一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，特别是涉及一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒，其特征在于：所述引物组合包括TCR 5’Oligo接头，TCR 3’Oligo (dT)引物，TCR C区引物，标签上下游引物，所述试剂盒含有如权利要求1或2所述的引物组合。通过从接头的上游引物到C区的下游引物，获得T细胞受体（TCR）基因序列的全长信息。

Primer combination and kit for high throughput sequencing detection of minimal residual disease in T cell leukemia

The invention belongs to the field of molecular biology, in particular relates to high-throughput sequencing to detect T cell leukemia minimal residual disease and primer combination kit, which is characterized in that the primers including TCR 5 'Oligo TCR 3' Oligo joint, (dT) primer, primer TCR C area. Tag primer kit containing the primer combinations of claim 2 wherein 1 or. The full-length information of the T cell receptor (TCR) gene sequence was obtained by upstream primers from the junction to the downstream primers of the C region.

【技术实现步骤摘要】
一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒
本专利技术属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒。
技术介绍
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能，T细胞白血病属于T细胞的恶性克隆性增值。随着化疗、特异靶向治疗、造血干细胞移植(HSCT)治疗等技术的不断改进，白血病的治疗效果日益改善，然而复发仍是困扰白血病治愈的一个难点，究其原因主要与白血病细胞微小残留病(MRD)有关。MRD是指经过诱导治疗达到完全缓解时，患者体内残存的少量白血病细胞。近年来研究表明，白血病复发与MRD密切相关，MRD升高可提前预示白血病的全面复发。因此，采用灵敏度高、特异性强及稳定可靠的试验方法对白血病患者进行定期MRD检测，对评估疾病状态、判断疗效、预测复发、指导治疗具有重要的临床意义。T细胞白血病患者有>50％的复发率，因此要定期检测MRD，来帮助设计个性化的治疗方法。目前检测MRD的方法主要依赖于分子免疫学技术如流式细胞仪术(flowcytometry)，但其灵敏度最高仅可达10-4数量级(0.01％)，且该方法对MRD结果的判断在很大程度上有赖于每个实验室的实验条件和操作者的个人经验，标准化程度低，而且有研究表明在化疗过程中由于化疗药物的影响使白血病细胞的免疫表型发生变化，即“免疫漂移”现象，可影响MRD结果的可靠性和准确性。T细胞基因座上大量的V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)基因片段在T细胞受体的形成中会产生各种多样性重组。这种V-D-J基因的重组赋予了每一种T细胞自己独特的T细胞受体(TCR)，从而使得每一个TCR的序列能有效的成为一个T细胞克隆的唯一生物标志物。因此对T细胞TCR基因的序列组成进行测序，可以很好的定位每一种T细胞，其中包括白血病癌变的T细胞。并且灵敏度最高可达10-6(0.0001％)。由于TCR基因的最大特点是V、D、J基因片段的随机重组，所以，针对未知基因序列，很难设计一个上游引物用于识别TCR基因的5’端序列，所以也无法利用PCR技术扩增TCR基因和测序。而另外一种TCR测序方法，即多重引物PCR的方法，只能测序TCR基因中的部分序列信息，这样使得测序基因信息不完整。另外，多重引物PCR方法的引物是根据已知V，J基因设计的，但在癌症病人中，癌细胞的基因突变是很常见的，如果白血病癌细胞的TCR产生了突变，那么已知序列的引物就有可能无法识别突变后的基因，对检测结果来说，就容易造成假阴性。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒,通过高通量测序构建T细胞白血病微小残留病TCR文库,以及构建的cDNA接头和单对引物，通过从接头的上游引物到C区的下游引物，获得TCR基因序列的全长信息。引物组合能有效的扩增TCR基因的全序列。使TCR二代测序文库构建效率高效，试剂盒为用户提供了简单便捷的使用方法，效率稳定。解决以上技术问题的一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括TCR5’Oligo接头，TCR3’Oligo(dT)引物，TCRC区引物，标签上下游引物，每种引物序列如下：TCR5’Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG3’；TCR3’Oligo(dT)引物：5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA3’；TCR5’端接头引物序列为：5’GTCTCGTGGGCTGGGCGATGTGTATGAGAGACAGCATGCATCGGATCTTCAGCATGA3’；TCRC区引物序列为：5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG3’；标签上游引物：5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index1]GTCTCGTGGGCTGG3’；标签下游引物：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[index2]TCGTCGCCAGCGTC3’；其中，所述index1为ATCTATCG、TCAGGTGA、CACTAGTT、GAATTGCC、ATGTACAA、GATTCAGT、CTGTTCGT或TATACGGC中的一种；index2为TAGCTACT、ATTATAGC、CCCGTACT、GGGTATAA、AGCAGGTG、TATACGTA、CACCTAGT或GTTGCTAC中的一种。本专利技术中一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的试剂盒，其特征在于：含有权利要求1或2所述的引物组合。本专利技术的优化方案中所述试剂盒还包括PCR缓冲液、Q5High-Fidelity2XMasterMix、去核酸酶水、AMPureXPBeads和70％乙醇。进一步优化方案中所述试剂盒包括：(1)PCR缓冲液：9.5μL；(2)阳性对照RNA(1μg/μl)：10μL；(3)10μMTCR3’Oligo(dT)引物：1.1μL；(4)10μMTCR5’端接头引物和10μMTCRC区引物：各1.1μL；(5)Q5High-Fidelity2XMasterMix：55μL；(6)10μM标签上游引物和10μM标签下游引物：各1.1μL；(7)去核酸酶水：105μL；(8)AMPureXPBeads：88μL；(9)70％乙醇：165μL。所述PCR缓冲液由以下体系组成：试剂盒的制备步骤为购买原料，然后组装成试剂盒。所有的试剂都是可以购买的，引物可以提供序列给引物合成公司，他们可以合成。按照需要比例，装入自己的试管，封装成试剂盒。利用本专利技术中的引物及试剂盒进行高通量测序检测T细胞白血病微小残留病，包括如下步骤：(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077(美国Sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；淋巴细胞分离液的作用在于可以从全血里分离淋巴细胞，因为检测对象为T细胞，T细胞属于淋巴细胞的一种，分离后的细胞群所获得的RNA是除去了红细胞、血小板等细胞的RNA的。所以建库使用的总RNA内含T细胞RNA模板纯度更高。(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzolRT(美国MRC公司#RN190)；Trizol的方法提取RNA是传统方法，也不存在有特色或者我们想申请专利保护的地方，所以我并未详细写出步骤。步骤如下：收获细胞，转移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g×10min，弃上清。加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5min，弃上清。自然风干，加入50ul的DEPCH2O溶解，得到淋巴细胞总RNA。(4)RNA反转录成cDNA，并同时在cD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括TCR 5’Oligo接头，TCR 3’Oligo(dT)引物，TCR C区引物，标签上下游引物，每种引物序列如下：TCR 5’Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG 3’；TCR 3’Oligo(dT)引物：5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA 3’；TCR 5’端接头引物序列为：5’GTCTCGTGGGCTGGGCGATGTGTATGAGAGACAGCATGCATCGGATCTTCAGCATGA 3’；TCR C区引物序列为：5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG 3’；标签上游引物：5’

【技术特征摘要】
1.一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括TCR5’Oligo接头，TCR3’Oligo(dT)引物，TCRC区引物，标签上下游引物，每种引物序列如下：TCR5’Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG3’；TCR3’Oligo(dT)引物：5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA3’；TCR5’端接头引物序列为：5’GTCTCGTGGGCTGGGCGATGTGTATGAGAGACAGCATGCATCGGATCTTCAGCATGA3’；TCRC区引物序列为：5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG3’；标签上游引物：5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index1]GTCTCGTGGGCTGG3’；标签下游引物：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[index2]TCGTCGCCAGCGTC3’。2.根据权利要求2所述的一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合，其特征在于：所述index1为ATCTATCG、TCAGGTGA、CACTAGTT、GAATTGCC、ATGTACAA、GATTCAGT、CTGTTCGT或TATACGGC中的一种；i...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙涛，刘潇，
申请(专利权)人：孙涛，
类型：发明
国别省市：四川,51