一种用于检测药物性耳聋相关位点的非标记探针制造技术

本发明专利技术涉及一组用于检测药物性耳聋相关位点的非标记探针。分别针对两个位点设计与突变型序列完全匹配、3’端氨基封闭的非标记探针，通过高分辨率熔解曲线分析(HRM)结合非标记探针，检测嵌入双链DNA的饱和染料EvaGreen荧光值的变化，得到探针与不同基因型目的片段解链的Tm值，并通过野生型和突变型不同的Tm值对其进行区分。分别成功地区分了两个位点的野生型和突变型个体，实现了对两个突变位点的单重检测。本体系适用于检测线粒体DNA中C1494T和A1555G突变，具有结果准确、可靠，重复性好，价格低廉的特点。

A non labeled probe for detecting drug deafness related sites

The present invention relates to a set of non labeled probes for detecting drug deafness related sites. The unlabeled probe respectively for two loci design and mutant sequences perfectly matched, 3 'end amino closed, by high resolution melting curve analysis (HRM) - labeled probe with EvaGreen fluorescence dye detection, change of saturated embedded double stranded DNA value, get probes with different genotype fragment solution chain Tm value, and by the wild type and mutant type of different Tm value to distinguish the. Wild type and mutant individuals of two loci were successfully isolated, and single detection of two mutation sites was achieved. The system is suitable for the detection of C1494T and A1555G mutations in mitochondrial DNA, and has the characteristics of accurate, reliable, reproducible and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测药物性耳聋相关位点的非标记探针
本专利技术属于生物医药领域,具体而言,涉及一种用于检测药物性耳聋相关位点的非标记探针。
技术介绍
耳聋是导致语言交流障碍的最常见的疾病之一，严重影响了患者的日常交流，降低患者的生活质量。据世界卫生组织（WHO）估计，全球有2.78亿人患有中度以上的听力障碍，且三分之二在发展中国家[1]。耳聋可以由单一基因突变或多基因复合突变引起，也可由环境因素造成，或基因与环境共同作用而导致[2]。由于部分人对耳毒性药物如氨基糖苷类药物有易感性，使用正常剂量或者微量的药物就可造成听力损伤[3]。氨基糖甙类抗生素会在耳蜗毛细胞中的线粒体和溶酶体积聚，且代谢缓慢，从而对听力产生伤害[4]。线粒体12SrRNA基因突变和大多数的耳聋有关。1993年，Prezant等人通过对患病家族线粒体基因序列分析,首次报道了线粒体12SrRNA上A1555G突变与药物性耳聋的关系[5]；2004年，Zhao等人首次在一个汉族家系中发现了C1494T突变与药物性耳聋的相关性[6]。目前的检测方法主要采用测序法[7]、PCR-RFLP法[8][9]、基因芯片法[10]和高分辨率熔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过高分辨率熔解曲线分析检测氨基糖甙类抗生素诱导的非综合征型耳聋相关位点12S rRNA C1494T、A1555G突变基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：(1)扩增C1494T和A1555G突变区域的两组引物对；(2)两条分别特异性结合由两组引物对扩增的片段的非标记探针；(3)必要的核酸扩增和杂交试剂。

【技术特征摘要】
1.一种通过高分辨率熔解曲线分析检测氨基糖甙类抗生素诱导的非综合征型耳聋相关位点12SrRNAC1494T、A1555G突变基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：(1)扩增C1494T和A1555G突变区域的两组引物对；(2)两条分别特异性结合由两组引物对扩增的片段的非标记探针；(3)必要的核酸扩增和杂交试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的两组引物对的核酸序列分别为：扩增C1494T引物对：引物1(SeqIDNo.2)：5’GAGTAGAGTGCTTAGTTGAACAGGG3’；引物2(SeqIDNo.3)：5’CCTCTATATAAATGCGTAGGGGTT3’；扩增A1555G引物对：引物3(SeqIDNo.4)：5’GGACATTTAACTAAAACCCCTACG3’；引物4(SeqIDNo.5)：5’AAGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTG3’；所述的非标记探针的序列为：探针1(SeqIDNo.6)：5’CTTGAGGAGAGTGACGGGCG3’；探针2(SeqIDNo.7)：5’CGACTTGCCTCCTCTATATAAA3’。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的非标记探针的3’末端采用氨基封闭，所使用的染料为EvaGreen。4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的熔解曲线分析的检测温度范围为45～95℃，优选的，针对1494位点野生型熔解峰在63℃，突变型熔解峰在67℃，温度差为4℃；1555位点野生型熔解峰在53℃，突变型熔解峰在61℃，温度差为8℃。5.使用权利要求1-4任一所述的试剂盒检测非综合征型耳聋的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测标本的DNA；(2)使用扩增C1494T引物对、扩增A1555G引物对、非标记探针组，与其他PCR反应体系成分混合，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢大儒，陈红岩，陈弘远，丁嘉琦，王超，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31