HOXB‑AS3多肽及编码其的开放阅读框制造技术

本发明专利技术公开了一种表达HOXB‑AS3多肽的方法及提供了编码其的开放阅读框序列，确认了编码HOXB‑AS3多肽的开放阅读框、起始密码子活性和HOXB‑AS3多肽在组织中的存在情况，确认HOXB‑AS3多肽是内源性天然存在，是真实存在的，其对应的起始密码子是有活性的，此起始密码子可以诱导HOXB‑AS3多肽的表达。

HOXB encoding AS3 polypeptide and its open reading frame

The invention discloses a method for expression of HOXB AS3 polypeptides and provides an open reading frame encoding the sequence encoding AS3 polypeptide HOXB confirmed the open reading frame, the start codon and HOXB AS3 polypeptide in activity exists in the organization, HOXB confirmed AS3 polypeptide is derived in natural existence is a real one, which corresponds to the start codon is activated, the expression of the initiation codon can induce HOXB AS3 polypeptide.

【技术实现步骤摘要】
HOXB-AS3多肽及编码其的开放阅读框
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及表达HOXB-AS3多肽方法及提供编码其的开放阅读框。
技术介绍
随着RNA深度测序的发展，大量先前未知的RNA转录本被鉴定。这些转录本中大概只有1％可以编码为蛋白质，其余绝大部分被认为是非编码RNA(non-codingRNAs，ncRNAs)。这些不具有蛋白编码潜能的基因组序列曾被一度认为是基因组在进化过程中累积的无功能的“垃圾序列”或者基因组中的“暗物质”。随着研究的深入，越来越多的证据表明这些曾经的“垃圾序列”可能具有重要的生物学功能。早在几十年前，人们就发现很多非编码RNA对生命活动具有重要作用，例如参与蛋白质合成的核糖体RNA(rRNAs)、转运RNA(tRNA)以及在信使RNA(mRNA)剪切和核定位过程中起到关键作用的小核RNA(snRNA)，这些非编码RNA往往被称为持家非编码RNA(housekeepingncRNAs)。结合2012年发布的ENCODE研究数据，人们意外地发现在占据人类基因组98.5％的非蛋白编码序列中，绝大多数被转录成长度大于200个碱基、不具备蛋白质编码功能的长链非编码RNA(Longnon-codingRNAs，lncRNAs)。目前研究发现lncRNAs主要作为信号分子、诱饵分子、向导分子和脚手架分子，在表观遗传、转录水平和转录后水平调节靶标基因的功能活性，从而参与正常生理和疾病的发生发展等过程。HOXB-AS3(HOXBgeneclusterantisenseRNA3)属于HOXB基因簇中的一个反义RNA，在NCBI人类基因数据库中注释为一个lncRNA(NR_033201.2)。到目前，还没有出现lncRNAHOXB-AS3能够编码出一个多肽的公开报道。针对现有技术中存在的上述问题，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供能启动HOXB-AS3多肽编码的起始密码子以及其开放阅读框序列，提供一种可令长链非编码RNAHOXB-AS3表达出一个多肽的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：HOXB-AS3多肽，所述HOXB-AS3多肽具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。优选地，所述HOXB-AS3多肽的氨基酸序列在灵长目动物中存在高度保守性。编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框，所述编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。一种重组载体，所述重组载体由如上述的开放阅读框与质粒构建得到。一种重组载体，所述重组载体由上述的开放阅读框在5′端连接非翻译序列后与质粒构建得到；所述开放阅读框的5′端连接的非翻译序列如SEQIDNO.3所示。一组引物对，所述引物对用于扩增得到上述的开放阅读框，所述引物对的两条引物分别由SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的序列组成。一组引物对，所述引物对用于扩增得到5′端连接非翻译序列的开放阅读框，所述引物对的两条引物分别由SEQIDNO.6和SEQIDNO.5所示的序列组成。制备上述重组载体的方法，包括利用PCR扩增合成具有如权利要求3所述的开放阅读框，插入到基因转移载体中，得到重组载体。优选的，制备权利要求上述重组载体的方法，包括利用PCR扩增得到融合基因，插入到基因转移载体中，得到重组载体。本专利技术的有益效果如下：本专利技术突破了传统认为HOXB-AS3是一个长链非编码RNA的认识，研究开发出一种长链非编码RNAHOXB-AS3表达出一个多肽的方法，本专利技术提供了能启动HOXB-AS3多肽编码的起始密码子以及其开放阅读框序列，从而利用此起始密码子翻译表达出HOXB-AS3多肽。附图说明图1为实施例1中lncRNAHOXB-AS3序列中对应的HOXB-AS3氨基酸序列，开放阅读框(ORF)的核苷酸序列，起始密码子和终止密码子的位置；图2为实施例1中HOXB-AS3多肽的氨基酸序列在物种中的保守性；图3为实施例2中构建编码HOXB-AS3多肽的融合基因表达载体示意图；图4A为实施例2中采用抗Flag抗体的免疫荧光分析融合基因表达载体表达HOXB-AS3-Flag融合多肽的结果图；图4B为实施例2中采用抗HOXB-AS3多肽抗体的免疫荧光分析融合基因表达载体表达HOXB-AS3-Flag融合多肽的结果图；图5为实施例2中采用抗Flag和HOXB-AS3多肽抗体的westernblotting检测分析融合基因表达载体表达HOXB-AS3-Flag融合多肽的结果图；图6A为实施例3中用质谱技术鉴定HOX3-AS3多肽中的PVLPGTQRYPHQR肽段序列；图6B为实施例3中用质谱技术鉴定HOXB-AS3多肽中的FQAAGGGAESGK肽段序列；图6C为实施例3中用质谱技术鉴定HOXB-AS3多肽中的GSEEAPGVAWSGSESGR多肽序列；图6D为实施例3中用质谱技术鉴定HOXB-AS3多肽中的FQAAGGGAESGKRGSEEAPGVAWSGSESGR多肽序列；图7为实施例4中用抗HOXB-AS3多肽抗体免疫荧光检测细胞中内源性表达的HOXB-AS3多肽结果图；图8为实施例4中用抗HOXB-AS3多肽抗体westernblotting检测细胞中内源性表达的HOXB-AS3多肽结果图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。生物信息学预测lncRNAHOXB-AS3的核苷酸序列中存在编码多肽的开放阅读框(openreadingframe，ORF)，提供能编码HOXB-AS3多肽的ORF序列，ORF序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的专利技术人发现了能编码HOXB-AS3多肽的起始密码子位置和终止密码子位置。另外，本专利技术的专利技术人还提供了HOXB-AS3多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；通过同源比较确定此HOXB-AS3多肽序列在灵长目动物中存在高度保守性；专利技术人构建了用HOXB-AS3ORF序列和其起始密码子启动的HOXB-AS3ORF融合基因表达载体以及突变此起始密码子的融合基因表达载体；以验证HOXB-AS3ORF的起始密码子是否有活性。本专利技术的专利技术人确证了此HOXB-AS3多肽在细胞内是内源性表达和存在。实施例1利用lncRNAHOXB-AS3序列中存在的开放阅读框(ORF)编码HOXB-AS3多肽1.从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)核酸数据库中搜索获得注释为lncRNA的HOXB-AS3的RNA序列数据(NR_033201.2)，寻找在lncRNAHOXB-AS3的核苷酸序列上的开放阅读框(ORF)，开放阅读框的序列如SEQIDNO.2所示；SEQIDNO.2的序列如下：5′-ATGCCAGTGCTGCCGGGAACCCAGCGATATCCGCACCAGCGGAGAAGGTTCCAGGCTGCCGGCGGCGGCGCAGAGAGCGGGAAGAGAGGCTCGGAGGAAGCCCCGGGCGTGGCGTGGTCAGGCTCCGAGAGCGGCCGGGATGCGGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
HOXB‑AS3多肽，其特征在于，所述HOXB‑AS3多肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.HOXB-AS3多肽，其特征在于，所述HOXB-AS3多肽具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的HOXB-AS3多肽，其特征在于，所述HOXB-AS3多肽的氨基酸序列在灵长目动物中存在高度保守性。3.编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框，其特征在于，所述编码HOXB-AS3多肽的开放阅读框具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由如权利要求3所述的开放阅读框与质粒构建得到。5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由如权利要求3所述的开放阅读框在5′端连接非翻译序列后与质粒构建得到；所述开放阅读框的5′端连接的非翻译序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏光荣，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第三医院广州重症孕产妇救治中心，广州柔济医院，
类型：发明
国别省市：广东,44