一种生产左旋多巴的发酵培养基和发酵方法技术

本发明专利技术涉及微生物发酵技术领域，公开了一种生产左旋多巴的发酵培养基，每升发酵培养基中包括以下成分：酵母膏5～14g，蛋白胨7～13g，十二水磷酸氢二钠10～18g，硫酸钠5～10g，氯化钠0.1～1.5g，氯化铵1～6g，三水磷酸氢二钾7～16g，柠檬酸0.1～1g，七水硫酸镁0.1～1g，甘油1～10ml。本发明专利技术还包括使用上述发酵培养基生产左旋多巴的发酵方法。采用本发明专利技术的发酵培养基对种子液进行发酵，能够提高菌体活力，使低温诱导后菌体能够快速生长，缩短发酵周期，提高菌体的生物量。配制简单，成本较低。

Fermentation medium for producing L-dopa and fermentation method

The present invention relates to the field of microbial fermentation technology, discloses a fermentation medium for production of L-dopa, per liter of fermentation medium comprises the following components: yeast extract peptone 5 ~ 14g, 7 ~ 13g, twelve 10 ~ two sodium hydrogen phosphate 18G, sodium sulfate and sodium chloride of 5 ~ 10g, 0.1 ~ 1.5g, chloride 1 ~ 6G ammonium potassium hydrogen phosphate trihydrate, two citric acid 7 ~ 16g, 0.1 ~ 1g, seven ~ 1g water Magnesium Sulfate 0.1, glycerol 1 ~ 10ml. The present invention also includes a fermentation method for producing L-dopa using the same fermentation medium. When the seed medium is fermented by the fermentation medium of the invention, the vigor of the bacteria can be increased, and the bacteria can grow rapidly after the low temperature is induced, the fermentation cycle is shortened, and the biomass of the bacteria is increased. The preparation is simple and the cost is low.

【技术实现步骤摘要】
一种生产左旋多巴的发酵培养基和发酵方法
本专利技术涉及微生物发酵
，特别涉及一种生产左旋多巴的发酵培养基和发酵方法。
技术介绍
左旋多巴又名3,4-二羟基苯丙氨酸，为白色结晶性粉末，无臭无味，在乙醇、氯仿和丙酮中不溶，在稀酸中易溶，作为一种重要的生物活性物质，左旋多巴是神经递质多巴胺的前体，可以通过血脑屏障，进入脑循环而到达中枢神经系统，在中枢神经脱羧酶的作用下，转化为多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加达到治疗帕金森疾病。其结构式如下：左旋多巴是治疗老年帕金森病的首选和最有效药物，除此之外，左旋多巴还具有治疗弱视和心力衰竭的作用，虽然在长时间的使用以后会有一些副作用，但是四十余年过去了，目前仍然没有更好的替代药物出现。目前市面上左旋多巴的制备多是植物提取或化学合成。如专利201310700220.0中公开的左旋多巴制备是以农产品猫豆为原料提取制备左旋多巴。但是上述两种方法均无法保证原料来源，产量远远满足不了市场需求。随着分子生物学及生物技术的迅速发展，利用生物合成左旋多巴已经成为一种很有竞争力、前途光明的方法。在现有的左旋多巴发酵中，所采用的培养基成分没有设计好各成分之间的配比，只讲究成分充足全面，尤其是碳氮源配比和碳氮源与无机盐离子的配比，成分非常复杂，配制较为繁琐。现有技术的发酵培养基中，培养基成分豆饼水解液等成分属于迟效氮源，会使种子培养时间较长，L-酪氨酸的存在使菌体在较短时间内无法达到降温诱导的标准，磷酸吡哆醛等成分价格昂贵。发酵周期长，价格昂贵，发酵成本高，对于提高发酵效果并不明显。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种生产左旋多巴的发酵培养基和发酵方法，解决现有技术中发酵原材料成本高，发酵周期长和发酵效果较差的缺点。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种生产左旋多巴的发酵培养基，每升发酵培养基中包括：酵母膏5～14g，蛋白胨7～13g，十二水磷酸氢二钠10～18g，硫酸钠5～10g，氯化钠0.1～1.5g，氯化铵1～6g，三水磷酸氢二钾7～16g，柠檬酸0.1～1g，七水硫酸镁0.1～1g，甘油1～10ml。优选的，上述发酵培养基，每升发酵培养基中包括：酵母膏7～10g，蛋白胨9～11g，十二水磷酸氢二钠12～16g，硫酸钠7～9g，氯化钠0.5～1.0g，氯化铵3～5g，三水磷酸氢二钾9～12g，柠檬酸0.4～0.7g，七水硫酸镁0.3～0.8g，甘油3～7ml。本专利技术还提供了一种生产左旋多巴的发酵方法，包括如下步骤：(1)将重组大肠杆菌种子液接种于上述发酵培养基中进行发酵，控制发酵的pH为6.0～9.0，发酵温度为34～38℃，发酵DO≥30％；(2)当发酵液的OD600为25～30时，将发酵温度降温至15～25℃，加入诱导剂继续培养；(3)当发酵罐内OD不增加时，收集菌体，提取菌体中的左旋多巴。其中，优选的，所述步骤(1)后还包括补料步骤：当所述发酵培养基的DO和pH值同时上升时，开始补料，维持发酵液的DO在20％～40％。进一步优选的，所述补料的补料培养基配方为：每升补料培养基中含有酵母膏10～50g，蛋白胨20～60g，甘油200～600g。优选的，所述步骤(2)中，发酵温度降温至20℃后，当发酵液的OD600达到20～80时，在所述发酵液中加入微量元素液。进一步优选的，所述微量元素液的配方为：每升微量元素液中含有ZnSO4·7H2O1～10g,柠檬酸铁铵2～8g，MnSO4·5H2O1～5g,H3BO35～13g,FeCl33～9g。进一步优选的，所述微量元素液加入的体积为所述发酵液体积的0.1～2％。优选的，所述种子液的接种量为1％～5％。优选的，所述步骤(1)中，发酵在发酵罐中进行，所述发酵罐的转速为100～300rpm，通气量为0.5～1.5vvm，压力为0.01～1Mpa。现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术对生产左旋多巴的发酵培养基的各成分及其配比进行调整，重点是对碳氮源和无机盐离子的种类和配比进行调整，很好的解决了现有技术中发酵培养基发酵时间长的缺点。采用本专利技术的发酵培养基对种子液进行发酵，能够提高菌体活力，使低温诱导后菌体能够快速生长，缩短发酵周期，提高菌体的生物量。且本专利技术的发酵培养基配制简单，成本较低。在该发酵方法中，发酵过程满足了菌体对溶氧需求，根据溶氧的消耗情况及时补充罐内溶氧条件，使菌体的生长得以稳定地进行，当基础料碳氮源消耗殆尽后，及时补充营养物质，使菌体在一种半饥饿状态进行持续生长，既避免了代谢副产物的积累，又满足了菌体生长对营养物质的需求。在现有技术中，发酵周期大都在24h以上，发酵结束时OD600在50左右，菌体湿重低于80g/L。本专利技术的发酵方法，发酵周期在20h左右，发酵结束时菌体OD600在80以上，菌体湿重大于100g/L。具体实施方式本专利技术提供了一种生产左旋多巴的发酵培养基，每升发酵培养基中包括以下成分：酵母膏5～14g，蛋白胨7～13g，十二水磷酸氢二钠10～18g，硫酸钠5～10g，氯化钠0.1～1.5g，氯化铵1～6g，三水磷酸氢二钾7～16g，柠檬酸0.1～1g，七水硫酸镁0.1～1g，甘油1～10ml。优选每升发酵培养基中包括以下成分：酵母膏7～10g，蛋白胨9～11g，十二水磷酸氢二钠12～16g，硫酸钠7～9g，氯化钠0.5～1.0g，氯化铵3～5g，三水磷酸氢二钾9～12g，柠檬酸0.4～0.7g，七水硫酸镁0.3～0.8g，甘油3～7ml。本专利技术对上述发酵培养基中所用的成分来源没有特殊限制，采用本领域中的常用物质即可，也可以采用市售商品。本专利技术对发酵培养基的配制方法没有特殊限定，采用本领域中培养基的常规配制方法进行制备即可。上述生产左旋多巴的发酵培养基，蛋白胨作为一种迟效氮源物质，满足了菌体生长繁殖和合成胞内物质所需要的蛋白质来源，甘油作为一种碳源物质，满足了菌体生长繁殖所需要的碳骨架和能量来源，酵母膏可同时作为碳氮源，氯化铵可作为菌体快速生长的速效氮源，无机盐离子对菌体的生长和产物的合成具有调节和促进作用。该培养基配方能够提高菌体活力，使低温诱导后菌体能够快速生长，缩短发酵周期，还能够提高菌体发酵的生物量。本专利技术还提供了一种利用上述发酵培养基生产左旋多巴的发酵方法，包括如下步骤：(1)将重组大肠杆菌种子液接种于本专利技术的发酵培养基中进行发酵，控制发酵的pH为6.0～9.0，发酵温度为34～38℃，发酵DO≥30％；(2)当发酵液的OD600为25～30时，将发酵温度降温至15～25℃，加入诱导剂继续培养；(3)当发酵罐内OD不增加时，收集菌体，提取菌体中的左旋多巴。本专利技术对重组大肠杆菌的种子液来源没有特殊限制，优选将重组大肠杆菌菌种进行分离纯化后，在种子培养基中对菌种进行培养，制备重组大肠杆菌的种子液。本专利技术对重组大肠杆菌的菌种来源没有特殊限定，可以采用本领域技术人员熟知的能够生产左旋多巴的重组大肠杆菌。在本专利技术具体实施例中采用的是基因工程菌E.coliM15，购自香港标新特有限公司。本专利技术对重组大肠杆菌的分离纯化方法没有特殊限制，采用本领域的常规分离纯化方法即可。本专利技术具体实施例中对重组大肠杆菌采用平板划线法进行分离纯化。本专利技术中重组大肠杆菌的平板培养基配方(g/L)优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产左旋多巴的发酵培养基，其特征在于，每升发酵培养基中包括：酵母膏5～14g，蛋白胨7～13g，十二水磷酸氢二钠10～18g，硫酸钠5～10g，氯化钠0.1～1.5g，氯化铵1～6g，三水磷酸氢二钾7～16g，柠檬酸0.1～1g，七水硫酸镁0.1～1g，甘油1～10ml。

【技术特征摘要】
1.一种生产左旋多巴的发酵培养基，其特征在于，每升发酵培养基中包括：酵母膏5～14g，蛋白胨7～13g，十二水磷酸氢二钠10～18g，硫酸钠5～10g，氯化钠0.1～1.5g，氯化铵1～6g，三水磷酸氢二钾7～16g，柠檬酸0.1～1g，七水硫酸镁0.1～1g，甘油1～10ml。2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，每升发酵培养基中包括：酵母膏7～10g，蛋白胨9～11g，十二水磷酸氢二钠12～16g，硫酸钠7～9g，氯化钠0.5～1.0g，氯化铵3～5g，三水磷酸氢二钾9～12g，柠檬酸0.4～0.7g，七水硫酸镁0.3～0.8g，甘油3～7ml。3.一种基于权利要求1或2所述发酵培养基生产左旋多巴的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将重组大肠杆菌种子液接种于权利要求1或权利要求2所述发酵培养基中进行发酵，控制发酵的pH为6.0～9.0，发酵温度为34～38℃，发酵DO≥30％；(2)当发酵液的OD600为25～30时，将发酵温度降温至15～25℃，加入诱导剂继续培养；(3)当发酵罐内OD不增加时停止发酵，收集菌体，提取菌体中的左旋多巴。4.根据权利要求3所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：金伟，郑长春，王博，慕东，张兴灿，卢春玲，陈君，张勇，
申请(专利权)人：山东鲁抗医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37