一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的发酵方法技术

本发明专利技术提供了一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的发酵方法，属于微生物发酵技术领域。为解决目前枯草芽孢杆菌发酵活菌水平低，芽孢形成不稳定等问题，本发明专利技术提供以下方案：种子液接种于发酵罐的灭菌培养基中，分发酵时间段控制温度发酵：34‑37℃培养4h，35‑40℃发酵8h，37‑40℃至结束；分发酵时间段控制风量：控制通风量0.3‑0.6vvm发酵8h，控制通风量0.4‑1.0vvm至结束；发酵时长大于12h；发酵pH6.0‑7.0。使用本发明专利技术提供的方法发酵培养24h，最终枯草芽孢杆菌活菌数可达1.6×10

Method for fermenting Bacillus subtilis with high living bacteria number and high spore forming rate

The invention provides a method for fermenting Bacillus subtilis with high living bacteria number and high spore forming rate, belonging to the technical field of microbial fermentation. In order to solve the Bacillus subtilis fermentation bacteria level low, spore forming instability, the invention provides the following scheme: sterilization seed was inoculated in fermentation medium, fermentation time fermentation temperature control: 34 37 C 40 C 35 4H culture, fermentation 8h, temperature of 40 to 37 the end of fermentation time; control volume control ventilation: 0.3 0.6vvm fermentation 8h, 1.0vvm to control the ventilation quantity of 0.4 end; fermentation time of more than 7 pH6.0 12h; fermentation. By using the method provided by the invention, 24h is fermented and the number of live bacillus subtilis can reach 1.6 * 10

【技术实现步骤摘要】
一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的发酵方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌发酵方法。技术背景枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状好养型细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强，被广泛的应用于畜牧、医药、植物病害防治等领域，具有广泛的应用前景，显示出巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌微生态制剂绝大部分产品都是以活菌发挥作用的，有效活菌数是衡量微生态制剂质量的重要指标，产品中必须含有相当数量的活菌数才能发挥作用。但是微生态制剂随着保存时间延长，活菌量减少，在一定时期内，其有效活菌数影响使用效果。然而，目前广泛应用的活菌制剂由于发酵活菌水平低，芽孢形成不稳定给实际应用带来困难。目前，枯草芽孢杆菌活菌制剂发酵所得枯草芽孢杆菌活菌数最高仅达1.0×1010cfu/ml，芽孢率90％，由于现有微生物发酵技术的不足上述活菌数和芽孢率很难再提高。因此，如何获得有效活菌数更高的产品，是饲用微生态制剂生产中最核心的工艺问题。这也是发酵工业领域的热点问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有存在的技术缺陷，即活菌制剂发酵活菌水平低，芽孢形成不稳定等问题，提供一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的发酵方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的发酵方法，包括：发酵罐中加入灭菌的液体发酵培养基，将种子液按照质量百分数5％接种于发酵罐的灭菌培养基中,培养条件为：从发酵起始时间起算，分发酵时间段控制温度发酵：控制温度34-37℃培养4h，控制温度35-40℃发酵8h，控制温度37-40℃发酵直至发酵结束；从发酵起始时间起算，分发酵时间段控制风量：控制通风量0.3vvm-0.6vvm发酵8h，控制通风量0.4vvm-1.0vvm发酵直至发酵结束；发酵总时长大于12h；发酵过程pH6.0-7.0；搅拌转速300rpm-800rpm。(根据溶氧值调整，溶氧值升高，降低搅拌转速；溶氧值降低，升高搅拌转速)。优选的，所述液体发酵培养基组成成分按照质量百分比包括：碳源3％-5％，氮源3％-6％，磷酸二氢钾0.01％-0.03％，七水合硫酸镁0.01％-0.02％，高温淀粉酶0.02％，其余为水，液体发酵培养基配置后、使用前需灭菌。优选的，所述碳源为玉米粉、蔗糖、乳糖或可溶性淀粉的一种或多种；所诉氮源为豆粕粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨或玉米浆的一种或多种。优选的，所述液体发酵培养基体积占发酵罐容积的40％。优选的，所述种子液的制备方法为：将菌种从砂土管挑取菌落直接接种于茄子瓶斜面，培养温度37℃，培养时间72h；用接种铲将整个茄子瓶斜面接种于装有玻璃珠和无菌水的三角瓶中，放置摇床控制温度37℃，培养2h，转速180rpm。优选的，所述的茄子瓶斜面培养基组成成分按照质量百分比包括：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，氯化钠1％，琼脂1.5％，自然pH，其余为水，配置后、使用前需在121-123℃下灭菌40min。有益效果：1、采用新的培养基配方，使枯草芽孢杆菌活菌发酵周期缩短、活菌数明显提高，发酵24h最高达到1.6×1010cfu/ml，比现有技术最高水平提高了近60％，取得了预料不到的技术效果。2、发酵过程中，采用分时间段控制通风量的技术方案，使枯草芽孢杆菌发酵活菌数明显提高，发酵24h最高达到1.6×1010cfu/ml，比现有技术最高水平提高了近60％，取得了预料不到的技术效果。3、发酵过程中，采用分时间段控制温度的技术方案，所得枯草芽孢杆菌发酵24h芽孢率最高可达96％，显著提高产品的芽孢数和产品质量。具体的实施方式：为了更好理解本专利技术，以下用实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：1)菌株制备：将上述复筛效果较好的突变株在斜面LB培养基(斜面培养基按照质量百分比，由如下成分组成：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，氯化钠1％，自然pH，121℃、0.11Mpa灭菌20min)培养3天后，进行砂土管保藏。培养温度37℃，培养时间72h。2)种子培养：将砂土管直接接种于茄子瓶斜面(茄子瓶斜面培养基按照质量百分比，由如下成分组成：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，氯化钠1％，自然pH，121℃、0.11Mpa灭菌20min)，培养温度37℃，培养时间3天，制备种子液。3)发酵罐养：采用5L发酵罐中发酵培养基体积2L(发酵培养基按照质量百分比，由如下成分组成：碳源玉米粉3％，氮源豆粕3％，磷酸二氢钾0.01％，七水合硫酸镁0.01％，高温淀粉酶0.02％，调节pH6.0，121-123℃，灭菌40min)，将制备好的种子液接种于5L发酵罐的灭菌培养基中。培养条件为，分发酵时间段控制温度，发酵开始，控制温度34℃培养4h；温度35℃发酵8h；控制温度37℃发酵至结束。分发酵时间段控制风量：发酵开始，控制通风量0.3vvm培养8h；通风量0.4vvm至培养结束。发酵过程控制pH6.0，控制搅拌转速300rpm。发酵时长共24h，结束发酵后收集发酵培养液得到高芽孢率枯草芽孢杆菌液体产品，混皿阀检测得到活菌数1.4×1010cfu/ml，芽孢率94％。本实施例采用新的培养基配方，使枯草芽孢杆菌活菌发酵周期缩短、活菌数明显提高，发酵过程中采用分时间段控制通风量的技术方案，使枯草芽孢杆菌发酵活菌数明显提高，发酵24h达到活菌数1.4×1010cfu/ml。发酵过程中采用分时间段控制温度的技术方案，所得枯草芽孢杆菌发酵24h芽孢率达96％，显著提高产品的芽孢数和产品质量。实施例21)菌株制备：将上述复筛效果较好的突变株在斜面LB培养基(斜面培养基按照质量百分比，由如下成分组成：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，氯化钠1％，自然pH，121℃、0.11Mpa灭菌20min)培养3天后，进行砂土管保藏。培养温度37℃，培养时间72h。2)种子培养：将砂土管直接接种于茄子瓶斜面(茄子瓶斜面培养基按照质量百分比，由如下成分组成：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，氯化钠1％，自然pH，121℃、0.11Mpa灭菌20min)，培养温度37℃，培养时间3天。3)发酵罐养：采用5L发酵罐中发酵培养基体积2L(发酵培养基按照质量百分比，由如下成分组成：碳源玉米粉5％，氮源豆粕6％，磷酸二氢钾0.03％，七水合硫酸镁0.02％，高温淀粉酶0.02％，调节pH6.5，121-123℃，灭菌40min)，将制备好的种子液接种于5L发酵罐的灭菌培养基中。培养条件为，分发酵时间段控制温度，发酵开始，控制温度37℃培养4h；温度40℃发酵8h；控制温度40℃发酵至结束。分发酵时间段控制风量：发酵开始，控制通风量0.6vvm培养8h；通风量1.0vvm至培养结束。发酵过程控制pH7.0，控制搅拌转速800rpm。发酵时长共24h，结束发酵后收集发酵培养液得到高芽孢率枯草芽孢杆菌液体产品，混皿阀检测得到活菌数1.5×1010cfu/ml，芽孢率96％。本实施例采用新的培养基配方，使枯草芽孢杆菌活菌发酵周期缩短、活菌数明显提高，发酵过程中采用分时间段控制通风量的技术方案，使枯草芽孢杆菌发酵活菌数明显提高，发酵24h达到活菌数1.6×本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于：发酵罐中加入灭菌的液体发酵培养基，将种子液接种于发酵罐的灭菌培养基中，培养条件为：从发酵起始时间起算，分发酵时间段控制温度发酵：控制温度34‑37℃培养4h，控制温度35‑40℃发酵8h，控制温度37‑40℃发酵直至发酵结束；从发酵起始时间起算，分发酵时间段控制风量：控制通风量0.3vvm‑0.6vvm发酵8h，控制通风量0.4vvm‑1.0vvm发酵直至发酵结束；发酵总时长大于12h；发酵过程pH6.0‑7.0；搅拌转速300rpm‑800rpm。

【技术特征摘要】
1.一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于：发酵罐中加入灭菌的液体发酵培养基，将种子液接种于发酵罐的灭菌培养基中，培养条件为：从发酵起始时间起算，分发酵时间段控制温度发酵：控制温度34-37℃培养4h，控制温度35-40℃发酵8h，控制温度37-40℃发酵直至发酵结束；从发酵起始时间起算，分发酵时间段控制风量：控制通风量0.3vvm-0.6vvm发酵8h，控制通风量0.4vvm-1.0vvm发酵直至发酵结束；发酵总时长大于12h；发酵过程pH6.0-7.0；搅拌转速300rpm-800rpm。2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述液体发酵培养基组成成分按照质量百分比包括：碳源3％-5％，氮源3％-6％，磷酸二氢钾0.01％-0.03％，七水合硫酸镁0.01％-0.02％，高温淀粉酶0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，孙超，赵广，陈晓宇，肖东坡，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，河南仰韶生化工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37