线粒体基因组多态性构建黄瓜指纹图谱及其应用制造技术

本发明专利技术线粒体基因组多态性构建黄瓜指纹图谱及其应用，涉及黄瓜线粒体基因组标记开发，不同黄瓜品种间进行线粒体基因组多态性标记筛选，线粒体DNA指纹图谱的构建，以及线粒体DNA指纹图谱在杂交F1种子纯度鉴定方面的应用——利用多态性标记对“南水3号”种子进行纯度鉴定，属于生物技术育种领域。本发明专利技术首次基于黄瓜线粒体基因组父系遗传特性构建“长春密刺”等21份黄瓜品种的线粒体DNA指纹图谱，首次应用黄瓜线粒体基因组多态性标记检测“南水3号”黄瓜种子纯度，为黄瓜品种的鉴定、遗传亲缘关系分析，分类与进化等研究提供了一种新的方法，为追踪杂交过程中父系线粒体基因组做技术准备，为制定种苗纯度早期鉴定技术规范奠定基础。

Construction of cucumber fingerprint with mitochondrial genome polymorphism and its application

The invention of mitochondrial genome polymorphism to construct the cucumber fingerprint and its application to mitochondrial genome marker development of cucumber, mitochondrial genome polymorphism marker screening of different cucumber varieties, the construction of DNA fingerprint of mitochondria, and mitochondrial DNA fingerprinting in purity identification of hybrid seeds of F1 application, using the polymorphic markers of \project 3\ seed purity identification, belonging to the field of biotechnology breeding. This invention is the first construction of \Changchun Mici\ 21 cucumber cultivars of mitochondrial DNA fingerprinting genetic characteristics of cucumber based on paternal mitochondrial genome, the first application of cucumber mitochondrial genome polymorphism marker detection \project 3\ cucumber seed purity identification, analysis of genetic relationship of cucumber cultivars, provides a new research method the classification and evolution, to make technical preparations for paternal mitochondrial genome hybridization in the process of tracking, and lay the foundation for making the identification of technical specification for early seedling purity.

【技术实现步骤摘要】
线粒体基因组多态性构建黄瓜指纹图谱及其应用一、
本专利技术线粒体基因组多态性构建黄瓜指纹图谱及其应用属于生物技术育种领域，涉及黄瓜线粒体基因组标记开发，不同黄瓜品种间进行线粒体基因组多态性标记筛选，线粒体DNA指纹图谱的构建，以及线粒体DNA指纹图谱在杂交F1种子纯度鉴定方面的应用——利用多态性标记对“南水3号”种子进行纯度鉴定。二、
技术介绍
DNA指纹图谱是指某一品种具有的区别于其他品种的特异DNA片段，其表现方式为一系列电泳图谱的差异，具有多位点性、高变异性和简单稳定的遗传性。DNA指纹图谱的研究，对于动物、植物和微生物的品种鉴定、品种资源评价与保存，遗传亲缘关系分析等具有重要意义。线粒体指纹图谱具有同样的意义，尤其对于父系遗传品种而言，它能快速检测杂交种子纯度，追踪花粉污染源。黄瓜(CucumissativusL.)属于葫芦科甜瓜属，一年生蔓性草本植物，在我国已有1500多年的栽培历史。在长期的自然选择过程中，形成了丰富多样的黄瓜栽培类型和品种。根据已有报道，黄瓜线粒体DNA是父系遗传，且短的分散重复序列占黄瓜线粒体基因组的13％，理论上为线粒体标记开发和应用奠定了基础。基于黄瓜核基因组的双亲遗传特性，RAPD、AFLP、ISSR等分子标记构建的部分黄瓜品种的指纹图谱已有报道。然而，基于黄瓜线粒体基因组父系遗传特性构建的黄瓜线粒体DNA指纹图谱还未见报道。本专利技术以“长春密刺”等21份黄瓜品种为材料，利用黄瓜线粒体基因组开发的标记，构建了21份黄瓜品种的线粒体DNA指纹图谱，为制定种苗纯度早期鉴定技术规范奠定基础。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种构建黄瓜线粒体DNA指纹图谱的方法，以期为黄瓜品种的鉴定、遗传亲缘关系分析，分类与进化等研究提供一种新的方法；以及线粒体DNA指纹图谱在杂交F1种子纯度鉴定方面的应用——利用多态性标记对“南水3号”种子进行纯度鉴定，以期区分母本南水2号植株上其他花粉来源的假杂交种和自交种，它是一种利用黄瓜线粒体父系遗传特性而确定的种子纯度鉴定方法。技术方案本专利技术基于黄瓜线粒体基因组父系遗传特性，构建黄瓜线粒体DNA指纹图谱，进行黄瓜杂交种种子纯度鉴定，其实施方案如下：1.黄瓜线粒体基因组标记开发：利用黄瓜线粒体基因组重测序数据与原线粒体基因组数据比对，设计黄瓜线粒体基因组引物，并结合实验室已有的黄瓜线粒体基因组SSR引物；2.黄瓜线粒体基因组标记多态性筛选：1)以“长春密刺”等21份黄瓜品种的DNA为模板，采用以下反应体系和PCR程序进行扩增，PCR反应体系总体积为24μL：2×Mix12μL，灭菌ddH2O9μL，正反向10μmolL-1引物各1μL，模板50ngμL-1DNA1μL，扩增程序优化后确定为：94℃预变性2min，94℃变性20s，68℃退火1min，72℃延伸30s，共6个循环，94℃变性20s，58℃退火1min，72℃延伸30s，共9个循环，94℃变性20s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共13个循环，72℃延伸5min，4℃保存，用81对线粒体引物分别对21份黄瓜样品进行PCR扩增；2)PCR扩增结束后，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，180v电泳3h后检测PCR扩增产物，银染显色后记录数据，拍照采集电泳图像；3.利用筛选出的9对多态性引物构建黄瓜线粒体DNA指纹图谱：多态性标记数据的记录：采用0、1系统描述条带的相对位置，清晰条带记为1，缺失记为0，依据分子量从小到大的顺序读带，不具多态性的条带不予统计；4.线粒体DNA指纹图谱的应用-杂交种种子纯度鉴定：“南水3号”是由“南水2号”和“一休弱雌”杂交获得的杂种一代，“南水2号”作为母本，是水果型黄瓜，“一休弱雌”作为父本，是来自日本的黄瓜品种，随机抽取母本和父本各3株，提取DNA，分别等物质的量混合，杂种一代70株，提取DNA，利用线粒体DNA指纹图谱中的多态性标记进行种子纯度鉴定，并将鉴定结果与田间形态鉴定结果进行比较，验证2种鉴定方法结果的一致性。有益效果本专利技术线粒体基因组多态性构建黄瓜指纹图谱及其应用，具有以下优点和积极效果：1)本专利技术利用黄瓜线粒体基因组标记探索了黄瓜线粒体DNA的多态性；2)本专利技术首次建立了“长春密刺”等21份黄瓜品种的线粒体DNA指纹图谱，为黄瓜品种的鉴定、遗传亲缘关系分析，分类与进化等研究提供了一种新的方法，为追踪杂交过程中父系线粒体基因组做技术准备，为新品种“南水3号”进行专利权的申请提供了分子依据。3)本专利技术首次利用黄瓜线粒体基因组多态性标记对“南水3号”种子进行快速的纯度鉴定，以期区分母本“南水2号”黄瓜植株上其他花粉来源的假杂交种和自交种，为制定“南水3号”种苗纯度早期鉴定技术规范奠定基础。四、附图说明图1：“长春密刺”等21份黄瓜品种线粒体基因组标记多态性筛选。1-A：mtSSR101-B：mt811-C：mt83图中，M：Marker，1：长春密刺；2：P01(G)；3：朝优3号；4：平望(G)；5：L8；6：二早子；7：Amir；8：8419s；9：欧美佳；10：树春美雅；11：EC5；12：407BeitAlpha；13：JCl；14：JC3；15：BoothbylsBlonde；16：HomenmadePickles；17：宁佳7号；18：翠玉八号；19：Hardwickii；20：一休弱雌；21：南水2号图2：“南水3号”黄瓜种子纯度检测(mtSSR4)。图中，M：Marker；1：“南水2号”；2：“一休弱雌”；3-70：“南水3号”表1线粒体基因组多态性引物及其序列Table1Polymorphismprimerinformationofmitochondrialgenome表221份黄瓜品种线粒体DNA数字化指纹图谱Table2ThemitochondrialDNAdigitalfingerprintmappingof21cucumbervarieties五、具体实施方式本实施以“长春密刺”等21份黄瓜品种作为材料，利用黄瓜线粒体基因组父系遗传特性，开发并筛选黄瓜线粒体基因组多态性标记，构建了“长春密刺”等21份黄瓜品种的线粒体DNA指纹图谱，以及利用多态性标记对“南水3号”种子进行快速纯度鉴定。实验过程如下：1.黄瓜线粒体基因组标记开发：利用黄瓜线粒体基因组重测序数据与原线粒体基因组数据比对，设计黄瓜线粒体基因组多态性引物，并结合实验室已有的黄瓜线粒体基因组多态性SSR引物；2.黄瓜基因组DNA提取及检测：用改良的CTAB法对黄瓜基因组DNA进行提取，经2μL10μgmL-1RNase消化后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，-20℃冰箱保存备用；3.黄瓜线粒体基因组标记多态性筛选：1)以“长春密刺”等21份黄瓜品种的DNA为模板，采用以下反应体系和PCR程序进行扩增，PCR反应体系总体积为24μL：2×Mix12μL，灭菌ddH2O9μL，正反向10μmolL-1引物各1μL，模板50ngμL-1DNA1μL，扩增程序优化后确定为：94℃预变性2min，94℃变性20s，68℃退火1min，72℃延伸30s，共6个循环，94℃变性20s，58℃退火1min，72℃延伸30s，共9个循环，94℃变本文档来自技高网...

【技术保护点】
黄瓜线粒体基因组标记开发：利用黄瓜线粒体基因组重测序数据与原线粒体基因组数据比对，设计黄瓜线粒体基因组多态性引物，并结合实验室已有的黄瓜线粒体基因组多态性SSR引物。

【技术特征摘要】
1.黄瓜线粒体基因组标记开发：利用黄瓜线粒体基因组重测序数据与原线粒体基因组数据比对，设计黄瓜线粒体基因组多态性引物，并结合实验室已有的黄瓜线粒体基因组多态性SSR引物。2.对权利1开发出的黄瓜线粒体基因组标记进行多态性筛选：1)以“长春密刺”等21份黄瓜品种的DNA为模板，采用以下反应体系和PCR程序进行扩增，PCR反应体系总体积为24μL：2×Mix12μL，灭菌ddH2O9μL，正反向10μmolL-1引物各1μL，模板50ngμL-1DNA1μL，扩增程序优化后确定为：94℃预变性2min，94℃变性20s，68℃退火1min，72℃延伸30s，共6个循环，94℃变性20s，58℃退火1min，72℃延伸30s，共9个循环，94℃变性20s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共13个循环，72℃延伸5min，4℃保存，用81对线粒体引物分别对21份黄瓜样品进行PCR扩增；2)PCR扩增结束后，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈劲枫，赵宇，沈佳，李海梅，娄群峰，李季，钱春桃，张璐，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32