脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种脂蛋白相关磷脂酶Lp‑PLA2活性及总量检测试剂盒及检测方法，所述检测试剂盒包括固相载体、酶分解底物、缓冲液、酶标抗体试剂、洗涤液、显色底物、终止液、酶活性校准品和酶免校准品，所述酶标板包被有抗‑Lp‑PLA2特异N端非抑制性抗体；所述酶分解底物为血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱；所述酶标抗体试剂为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素标记的抗‑Lp‑PLA2抑制性抗体；所述酶活性校准品包括含有多种浓度的对硝基酚标准品；所述酶免校准品包括含有Lp‑PLA2抗原的多个参考校准品。本发明专利技术可避免样本中其他物质的干扰，并更准确地反应Lp‑PLA2在体内的情况，为临床提供更准确的判断依据。

Lipoprotein associated phospholipase Lp PLA

The invention discloses a lipoprotein associated phospholipase Lp PLA

【技术实现步骤摘要】
脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及体外诊断领域，尤其涉及一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
据世界卫生组织统计，中国每年死于心脑血管疾病的人达300万以上，每10秒就有1人死于心血管病，我国心脑血管疾病发病和致死亡人数已位列第一，远远超过了癌症等其他疾病。随着我国人口的不断老龄化，患心脑血管疾病的人群逐年增加，并趋于低龄化；我国现患病人数已达6000万以上，每年发生卒中病人达200万，发病率高达120/10万，每年卒中病人死亡120万，是常发于老年男性55岁以上、女性65岁以上或绝经后妇女中的一种常见疾病。老年人、抽烟喝酒、高血压、糖尿病、肥胖、血脂异常、缺乏体力活动及精神压力大等人群为冠心病等系列心血管疾病的易感人群。血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)是磷脂酶A2(PhospholipaseA2，PLA2)超家族中的一员，由441个氨基酸残基组成，相对分子量为45.4kD，以酶活性形式循环在血液中。LP-PLA2是丝氨酸依赖的磷脂酶,其催化活性不需要钙离子。LP-PLA2酶活性区域位于蛋白C端，S273，D296，H351氨基酸残基组成酶催化活性核心位点；189-239氨基酸残基形成片成结构，参与控制酶底物的特异性，并为低密度脂蛋白(LDL)结合区域；367-370氨基酸残基参与高密度脂蛋白(HDL)结合。Lp-PLA2主要由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节，人循环中的Lp-PLA2以与脂蛋白颗粒结合的形式存在。Lp-PLA2是新近发现的一种具有强烈促炎症作用的生物学标记物，是一种新型的特异性的血管炎症标志物，其浓度或活性升高是心血管事件的独立危险因子，与心肌梗塞的发病风险和缺血性中风(脑动脉血栓)的发病风险正相关，可以作为冠心病和缺血性脑卒中动脉粥样硬化等心脑血管疾病的临床超前预测指标。新近美国FDA批准其用于预测冠心病和缺血性卒中风险。因此开发出一种新的用于心脑血管疾病超前预测的检测试剂盒，能够提前预测患者病情，及时治疗，降低患病风险和患者死亡风险，减轻社会负担、减轻病人的痛苦，简化了治疗的流程，降低医生的工作强度，同时也能大大降低国家、医院以及患者个人的治疗费用支出，减轻社会负担，具有重要的、积极的社会意义。在现有技术中，用酶联免疫法测定血液中LP-PLA2的含量，间接表明血液中LP-PLA2酶活性，而动脉硬化活动状况与血液中LP-PLA2酶活性相关，有时LP-PLA2含量与LP-PLA2活性并不相关，如LP-PLA2基因变异人群及血液中有LP-PLA2抑制物的人群；直接测定血液LP-PLA2酶活性方法是直接加LP-PLA2酶底物到血清/血浆中，其中LP-PLA2分解合成反应底物，生成颜色反应产物，再测算出LP-PLA2酶活性。这种方案的缺点是血液一些成分直接影响检测LP-PLA2酶活性的结果，如血红素，胆红素，代谢产物，药物等；血液或细胞液中还有LP-PLA2类似PLA2磷脂酶存在，也能水解LP-PLA2酶底物，降低检测血液LP-PLA2酶活性的特异性。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种新的脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2检测方式，来去除样品种其他杂质的干扰，提高Lp-PLA2测定的准确性。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒，包括有固相载体、酶分解底物、缓冲液、酶标抗体试剂、洗涤液、显色底物、终止液、酶活性校准品和/或酶免校准品，其中：所述固相载体包被有抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体；所述酶分解底物为血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱；所述酶标抗体试剂为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素标记的抗-Lp-PLA2抑制性抗体；所述酶活性校准品包括含有多种浓度的对硝基酚标准品；所述酶免校准品包括含有Lp-PLA2抗原的多个参考校准品；所述显色底物包含0.015-0.02％的过氧化物的显色底物A液和包含0.25-0.32g/L的TMB的显色底物B液。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2检测方法，用于采用如上所述的试剂盒对人血清或血浆中的脂蛋白相关磷脂酶进行活性及总量检测，包括：在酶标板的每孔中加入100ul抗Lp-PLA2N端抗体(5ug/ml)和50mM碳酸盐缓冲液，调节pH值为9.6，在4℃条件下静止8-12小时后，去除缓冲液；在酶标板的每孔中加入200μl封闭液，在4℃条件下封闭2小时后，去除封闭液；在酶标板的每孔中加入80ul样品稀释液和20ul血清或血浆样品，在室温下反应30分钟后，去除稀释液；加入200ul缓冲液和50ul酶分解底物，混合反应2分钟后，测定OD值；绘制酶活性-OD值标准曲线，算得待测样品中LP-PLA2酶活性；加入酶标抗体试剂100μl，置37℃继续温育30分钟；在酶标板的每孔中加入显色底物A液和显色底物B液各50μl混匀，37℃避光显色15分钟后，每孔加终止液50μl，混匀后10分钟内，测定校准品和待检样品的OD值；以校准品抗原浓度为横坐标、校准品相应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，并将待测样品OD值代入标准曲线中，算得待测样品中LP-PLA2浓度。本专利技术的有益效果是：本专利技术的实施例通过选用LP-PLA2N端非抑制性抗体，能特异性LP-PLA2N端，不干扰LP-PLA2C端酶催化结构区域酶活性，进行抗体扑获LP-PLA2酶活性测定试验，扑获出血液中LP-PLA2，去除了样本中其他物质的干扰，并可为酶活抑制剂的研发提供依据，酶总量及酶活性结果同时检测可更准确的反应Lp-PLA2在体内的情况，使临床做出更准确地判断。既改良了传统的酶检测法，又可继续完成酶联免疫检测，一个样本，一次检测，同时获得酶活性及总量的检测。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术的人脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测方法一个实施例中Lp-PLA2的含量曲线示意图。具体实施方式下面详细描述本专利技术提供的人脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒的一个实施例；本实施例主要包括有固相载体、酶分解底物、缓冲液、酶标抗体试剂、洗涤液、显色底物、终止液、酶活性校准品和/或酶免校准品，其中：所述固相载体包被有抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体；所述酶分解底物为血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱；所述酶标抗体试剂为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素标记的抗-Lp-PLA2抑制性抗体；所述酶活性校准品包括含有多种浓度的对硝基酚标准品；所述酶免校准品包括含有Lp-PLA2抗原的多个参考校准品；所述显色底物包含0.015-0.02％的过氧化物的显色底物A液和包含0.25-0.32g/L的TMB的显色底物B液。在一个具体的实施方式中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂蛋白相关磷脂酶Lp‑PLA

【技术特征摘要】
1.一种脂蛋白相关磷脂酶Lp-PLA2活性及总量检测试剂盒，其特征在于，包括有固相载体、缓冲液、酶分解底物、酶标抗体试剂、洗涤液、显色底物、终止液、酶活性校准品和酶免校准品，其中：所述固相载体包被有抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体；所述酶分解底物为血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱；所述酶标抗体试剂为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或生物素标记的抗-Lp-PLA2抑制性抗体；所述酶活性校准品包括含有多种浓度的对硝基酚标准品；所述酶免校准品包括含有Lp-PLA2抗原的多个参考校准品；所述显色底物包含0.015-0.02％的过氧化物的显色底物A液和包含0.25-0.32g/L的TMB的显色底物B液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体采用含有以下组分的包被液包被所述抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体：Na2CO3：1.59g/L；NaHCO3：2.93g/L；和/或者，所述固相载体采用含有以下组分的封闭液封闭所述抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体：BSA：10.0g/L；蔗糖：52.0g/L；酪蛋白：5.0g/L；NBS：100ml/L；明胶：5.0ml/L；50mMTB8.0：50ml/L；Proclin300：1.0ml/L。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体采用含有以下组分的缓冲液缓冲所述抗-Lp-PLA2特异N端非抑制性抗体：Hepes：4.8g/LNaCl：8.8g/LEDTA：1.5g/L；所述酶分解底物溶液包括有以下组分：血小板活化因子、血小板活化因子类似物或其氧化修饰的磷脂酰胆碱：1～3mmol/L；Citricacidmonohydrate：4.2g/L；Ethanol：100ml/L。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体试剂采用含有以下组分的稀释液：BSA：10.0g/L；蔗糖：52.0g/L；酪蛋白：5.0g/L；NBS：100ml/L；明胶：5.0ml/L；50mMTB8.0：50ml/L；Proclin300：1.0ml/L。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品包括有Lp-PLA2抗原含量分别为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml的至少一种校准品；且所述校准品采用含有以下组分的校准品稀释液：Na2HPO4·12H2O：53.7g/L；NaH2PO4·2H2O：7.8g/L；NBS：200ml/L；甘油：50ml/L；Tween-20：1ml/L；Proclin300：1ml/L。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色底物A液包括以下组分：三水合乙酸钠：27.2g/L；柠檬酸：3.2g/L；30％H2O2：0.6ml/L；和/或者，所述显色底物B液包括以下组分：乙二胺四乙酸二钠0.4g/L；柠檬...

【专利技术属性】
技术研发人员：仇家舟，陈雪，王朝阳，王岳鹏，黄知音，李玲玲，蒋萍，
申请(专利权)人：海格德生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44