败酱草中抗呼吸道合胞病毒物质的提取方法技术

败酱草中抗呼吸道合胞病毒物质的提取方法，它涉及中草药败酱草抗病毒物质的提取方法。呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）作为全球范围儿童病毒性呼吸道感染的重要病原之一，在呼吸道感染中占重要位置。本发明专利技术用水醇法制备乙醇沉淀物，向浓缩的水提液（１ｇ／ｍｌ）中缓慢加入９５％的乙醇，并不断搅拌，直至乙醇体积达到２０％～９０％后，于４℃温度下放置１２小时，于３５００转／分离心１０分钟，过滤收集沉淀。用大孔吸附树脂柱层析法制备败酱草抗呼吸道合胞病毒洗脱物，将乙醇沉淀物加水溶解后，加在预处理好的大孔吸附树脂柱顶端，用水洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥，得洗脱物Ａ。本发明专利技术具有提取工艺简单，提取的抗呼吸道合胞病毒物质纯度高的优点。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及中草药败酱草抗病毒物质的提取方法。
技术介绍
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)作为全球范围儿童病毒性呼吸道感染的重要病原之一，在呼吸道感染中占重要位置。RSV感染在1岁以下婴幼儿中易发展成严重的下呼吸道感染，还可诱发哮喘，甚至引起死亡，对婴幼儿危害较大。近年发现，RSV是成人免疫抑制者感染的重要病原，也可在老年人中流行，目前尚无令人满意的预防和治疗办法。呼吸道合胞病毒疫苗研制早在上世纪60年代就已开始，但目前仍无安全有效者。原因在于①婴儿体内的母传RSV抗体，可降低疫苗的免疫原性；②由于RSV自然感染激发的机体免疫是不完全免疫，因此RSV疫苗需多次接种；③RSV存在着A、B两个亚型，两亚型交叉中和活性低，故RSV疫苗应对两个亚型的RSV都具有保护作用。病毒唑(ribavirin)最早获美国食品药物管理局(FDA)批准用于治疗重症呼吸道合胞病毒感染。但由于其毒性较大，治疗费用昂贵，使用不方便，病毒唑的临床应用受到很大的限制。抗呼吸道合胞病毒的新药研究很多，包括单克隆抗体、干扰素、反义寡核苷酸等。尽管前景比较乐观，但短时间内还没有可以进入临床的药物。
技术实现思路
为解决已有技术存在的问题，本专利技术提供了一种，它应具有提取工艺简单，提取的抗呼吸道合胞病毒物质纯度高的特点。它还应具有利用细胞培养方法检测和证实败酱草抗病毒有效物质抑制呼吸道合胞病毒的作用，为开发研制新的抗病毒二类中药和进一步研究败酱草抗病毒有效成分，提供科学依据的特点，本专利技术首先制备败酱草的水提液，将败酱草(Herba patriniae)1kg，用自来水清洗五次，蒸馏水清洗三次，7000ml蒸馏水浸泡12小时，于100℃煮沸90分钟后用脱脂棉过滤，药渣加5000ml蒸馏水于100℃煮沸90分钟，用脱脂棉过滤，将两次滤液混合，混合滤液减压浓缩，浓缩到浓度为1g/ml(每ml含生药1克)。然后用水醇法制备乙醇沉淀物，向浓缩的水提液(1g/ml)中缓慢加入95％的乙醇，并不断搅拌，直至乙醇体积达到20％-90％后，于4℃温度下放置12小时，于3500转/分离心10分钟，过滤收集沉淀。将沉淀用适量双蒸水溶解后经滤纸过滤，滤液经旋转蒸发器浓缩，干燥，得粉末。还可用大孔吸附树脂柱层析法制备败酱草抗呼吸道合胞病毒洗脱物，将乙醇沉淀物加水溶解后，加在预处理好的大孔吸附树脂柱顶端，用水洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥，得洗脱物A。检验败酱草乙醇沉淀物对呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用，采用药物对比实验败酱草乙醇沉淀物。阳性对照药物病毒唑(Ribavirin)注射液，含量为100mg/ml，批号000302，烟台第二制药厂生产。人宫颈癌传代细胞Hela，由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。常规方法传代培养。呼吸道合胞病毒(RSV)Long株，由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。在Hela细胞中的组织半数感染量(TCID50)为10-7.7。药物毒性试验用细胞维持液将药液连续0.8倍稀释，按常量分别加入细胞已长成单层的％孔培养板中，置于37℃、5％CO2的温箱内培养，每日倒置显微镜下观察细胞形态，连续观察3天。每个剂量加入四孔细胞，同时设立四孔正常细胞对照。记录药物最大无毒剂量(TC0)。药物对呼吸道合胞病毒抑制作用的试验采用细胞病变抑制试验(CPEI)对败酱草乙醇沉淀物进行药效学检测。将呼吸道合胞病毒连续十倍稀释加入已长成单层的细胞，置于37℃、5％CO2的温箱内孵育2小时后加入药物(药物浓度根据最大无毒剂量确定)，再置于37℃、5％CO2的温箱内培养。每天观察细胞形态，连续观察3天，记录细胞病变(CPE)程度。CPE程度0表示无明显CPE，1表示CPE为0％～25％，2表示CPE为25％～50％，3表示CPE为50％～75％，4表示CPE为75％～100％。同时设立正常细胞对照、病毒对照和阳性药物对照各四孔。统计方法Kruskal-Wallis检验法比较药物对不同滴度呼吸道合胞病毒的抑制作用与病毒对照细胞病变程度。药物毒性测定结果根据药物毒性试验结果，败酱草乙醇沉淀物TC0为0.3125mg/ml；病毒唑TC0为11.52ug/ml。败酱草乙醇沉淀物对呼吸道合胞病毒抑制作用的试验结果见表1。表1败酱草乙醇沉淀物抗呼吸道合胞病毒的作用 用Kruskal-Wallis检验法比较败酱草沉淀物对不同滴度呼吸道合胞病毒的抑制作用与病毒对照细胞病变程度。结果表明，病毒滴度为10-6、10-7、10-8时，败酱草沉淀物对呼吸道合胞病毒均有明显的抑制作用(P＜0.01)。说明败酱草沉淀物具有明显的抑制呼吸道合胞病毒的作用。检验败酱草抗病毒有效物质(洗脱物A)对呼吸道合胞病毒的抑制作用实验药物洗脱物A(败酱草抗呼吸道合胞病毒有效物质)。阳性对照药物病毒唑(Ribavirin)注射液，含量为100mg/ml，批号000302烟台第二制药厂生产。人宫颈癌传代细胞Hela，由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。常规方法传代培养。呼吸道合胞病毒(RSV)Long株，由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。在Hela细胞中的组织半数感染量(TCID50)为10-7.7。药物毒性试验用细胞维持液将药液连续0.8倍稀释，按常量分别加入细胞已长成单层的％孔培养板中，置于37℃、5％CO2的温箱内培养，每日倒置显微镜下观察细胞形态，连续观察3天。每个剂量加入四孔细胞，同时设立四孔正常细胞对照。记录药物最大无毒剂量(TC0)，计算药物半数中毒浓度(TC50)。药物对呼吸道合胞病毒的抑制作用试验采用细胞病变抑制试验(CPEI)对药物进行药效学检测。已长成单层的细胞接种剂量为50TCID50的呼吸道合胞病毒，置于37℃、5％CO2的温箱内孵育2小时。然后弃去含病毒维持液，加入含不同浓度含药物的维持液，置于37℃、5％CO2的温箱内培养。每天观察细胞形态，连续观察3天，记录CPE程度。CPE程度0表示无明显CPE，1表示CPE为0％～25％，2表示CPE为25％～50％，3表示CPE为50％～75％，4表示CPE为75％～100％。同时设立正常细胞对照、病毒对照和阳性药物对照各四孔。计算药物半数有效剂量(EC50)和治疗指数(TI)。不同给药时间对病毒抑制的影响已长成单层的细胞中加入呼吸道合胞病毒，感染剂量为50 TCID50，置4℃1小时，弃去病毒液，于0小时，2小时，4小时，6小时，8小时分别加入同浓度洗脱物A及病毒唑，培养观察，记录CPE程度。统计方法Reed-Muench法计算药物半数中毒浓度(TC50)和半数有效浓度(EC50)、治疗指数(TI)＝半数中毒浓度(TC50)/半数有效浓度(EC50)；Kruskal-Wallis检验法比较药物各剂量组与病毒对照组细胞病变程度的总体分布及不同给药时间各组药物与病毒对照组细胞病变程度的总体分布。数据处理运用SAS软件完成。败酱草抗病毒物质对呼吸道合胞病毒抑制作用的试验结果见表2。Kruskal-Wallis检验法比较药物各剂量组与病毒对照组细胞病变程度。结果表明，败酱草水提液的5、2.5、1.25、0.625mg/ml剂量组，败酱草洗脱物A的2、1、0.5、0.25mg/本文档来自技高网...

【技术保护点】
败酱草中抗呼吸道合胞病毒物质的提取方法，它首先制备败酱草的水提液，将败酱草（Ｈｅｒｂａ　ｐａｔｒｉｎｉａｅ）１ｋｇ，用自来水清洗五次，蒸馏水清洗三次，７０００ｍｌ蒸馏水浸泡１２小时，于１００℃煮沸９０分钟后用脱脂棉过滤，药渣加５０００ｍｌ蒸馏水于１００℃煮沸９０分钟，用脱脂棉过滤，将两次滤液混合，混合滤液减压浓缩，浓缩到浓度为１ｇ／ｍｌ，其特征在于用败酱草水提液制备乙醇沉淀物，向浓缩的水提液（１ｇ／ｍｌ）中缓慢加入９５％的乙醇，并不断搅拌，直至乙醇体积达到２０％～９０％后，于４℃温度下放置１２小时，于３５００转／分离心１０分钟，过滤收集沉淀。将沉淀用双蒸水溶解后经滤纸过滤，滤液经旋转蒸发器浓缩，干燥，得粉末。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪源，
申请(专利权)人：李洪源，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]