一种粪便微生物样品DNA保存液制造技术

本发明专利技术涉及一种生物样本保存液，尤其涉及一种粪便微生物样品DNA保存液；本发明专利技术的粪便微生物样品DNA保存液，其中溶解有0.15‑0.35mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA‑2Na)、氯化钠(NaCl)、以及质量分数为12‑28％的二甲基亚砜(DMSO)，并调节pH至6.0‑9.0；本发明专利技术的粪便微生物样品DNA保存液，适用于常温下保存粪便微生物样品、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测。

【技术实现步骤摘要】
一种粪便微生物样品DNA保存液
本专利技术涉及一种生物样本保存液，尤其涉及一种粪便微生物样品DNA保存液。
技术介绍
人肠道中生存着10万亿到100万亿个细菌，分属数百到上千个不同的种属，其数量为人体细胞数量的10倍，基因数量是人体基因数量的150-200倍。这些共生在人体肠道中的微生物是人体一大未发现的“器官”，更有学者认为人本身就是人体细胞和细菌共同组合而成的共生生物体。它们与人体共生，以人体摄入的食物以及肠道分泌物为食，合成必需氨基酸，维生素，短链脂肪酸等物质进入人体，促进宿主健康；相反，其中一些病原菌也分泌有害物质进入体内，损害宿主的健康。由于肠道菌群的复杂和多样性，人类对其结构多样性和功能重要性一直缺乏足够的认知。直至近几年，随着二代测序等技术的进步，微生物组的黑盒才得以打开，并借助无菌动物的验证，发现了肠道微生物与大量的疾病直接相关，甚至在许多疾病中扮演了病因的角色。并且，其中大量的疾病，例如肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化、炎症性肠炎等，都是高发病率重要公共卫生问题。由于肠道微生物寄居在人的肠道内，因此，最便捷也是目前采用的最主要的方式是研究人体排出的粪便微生物，以此代表大肠内的共生微生物。粪便采集之后，通过提取细菌的总DNA，扩增核糖体16SrRNA可变区，测序以及一系列生物信息学分析，可以了解粪便中的细菌构成，进一步研究其和人体健康疾病之间的关系。由于粪便离体后，其环境也发生了变化，例如无氧环境转变成有氧环境，其中提供微生物代谢的能量来源也进入只消耗而不补充的状态。与此同时，其中的部分细菌还保持了活性，继续代谢和生长，而由于环境的变化，不同细菌其增长与死亡的速率已经不同于排便前。因此，需要对粪便进行一些保存措施，尽量将其中微生物的构成稳定在刚刚离体时的状态，从而最好的代表大肠中的共生微生物。现有技术中对于粪便微生物的保存，多采用低温冷冻的方法，例如中国专利公布号为CN102864138A的专利技术专利，公开了一种人类粪便DNA提取方法，即采用低温保存法，采集的粪便样本立即放于-20℃～-80℃，然而低温冷冻的方法需要大型设备配合使用，适用性较差，操作也较为复杂，不适于广泛的临床检测；常见的DNA保存液中，通常含有EDTA，虽然可以在常温下使用，然而这种DNA保存液并不适用于粪便微生物样品的DNA保存，具有使用局限性。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种适用于常温下保存粪便微生物样品、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测的粪便微生物样品DNA保存液。本专利技术的粪便微生物样品DNA保存液，其中溶解有0.15-0.35mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氯化钠(NaCl)、以及质量分数为12-28％的二甲基亚砜(DMSO)，并调节pH至6.0-9.0。进一步的，所述保存液中溶解有0.2-0.3mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)。具体的，所述保存液中溶解有0.25mol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)。进一步的，所述保存液中溶解有饱和氯化钠(NaCl)。进一步的，所述保存液中溶解有质量分数为17-23％的二甲基亚砜(DMSO)。具体的，所述保存液中溶解有质量分数为20％的二甲基亚砜(DMSO)。进一步的，所述保存液调节pH至7.0-9.0。具体的，所述保存液调节pH至8.0。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：按照以上配方配制保存液，将采集的粪便直接置于保存液中，无需冻存，即可达到稳定其中微生物构成的作用。使用该配方保存粪便样本，可以在常温下达到冻存粪便样本的效果，从而使采样者在任何时候都可以进行采样和样品的保存，也能够用于粪便样本的长途运输。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术3名志愿者4种处理方式下的肠道菌群香农多样性指数结果图；图2是本专利技术中第一志愿者门水平菌群构成异同分析结果图；图3是本专利技术中第二志愿者门水平菌群构成异同分析结果图；图4是本专利技术中第三志愿者门水平菌群构成异同分析结果图；图5是本专利技术中第一志愿者属水平菌群构成异同分析结果图；图6是本专利技术中第二志愿者属水平菌群构成异同分析结果图；图7是本专利技术中第三志愿者属水平菌群构成异同分析结果图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例一一、样品来源及分组保存方式采集3位志愿者的粪便样本。每个志愿者的样品采集9份，分别做9种不同的处理：冻存一周(标号0)：采集至少0.2g粪便样品，液氮速冻后，-80℃下密封保存，保存一周后进行DNA提取，16SrRNA基因V3/V4可变区扩增，文库构建、测序等处理；保存液保存一周(标号1-7)：采集至少0.2g粪便样品，使用本专利技术7种不同配方(成分如表1所示)室温下(25℃)密封，避光保存一周，然后进行DNA提取，16SrRNA基因V3/V4可变区扩增，文库构建、测序等处理；不做任何处理保存一周(标号8)：采集至少0.2g粪便样品，室温下(25℃)密封，避光保存一周，然后进行DNA提取，16SrRNA基因V3/V4可变区扩增，文库构建、测序等处理；二、粪便样本处理方法对上述粪便样本的处理过程如下：(1)粪便DNA提取a、样品处理：固体粪便(对应样品标号为0和8)：称取200mg固体粪便于2ml离心管中，加入800ulstoolDNABufferA，充分震荡混匀5min左右，1800g离心1min；从中取出50ul重悬液于干净的1.5ml离心管中，加入800ulLysis-BindingBuffer旋涡震荡混匀，70℃裂解5min。离心5min后转移上清至干净的1.5ml离心管中。粪便保存液(对应样品标号为1-7)：取200ul半液体状态的粪便加入不超过10％(w/v)的stoolDNABufferA进行稀释，充分震荡5min,从中取出50ul重悬液至干净的1.5ml离心管。b、加入混匀的磁珠20ul，旋涡震荡20s，室温静置4min,旋涡震荡20s，室温静置4min.c、置于磁架上，静止20s，吸取上清。d、加入500ulWashBufferW1,旋涡震荡混匀磁珠20s。e、置于磁架上，静置20s,弃上清。f、重复步骤e一次，并尽量除去所有液体。g、加入750ulWashBufferW2，旋涡震荡混匀磁珠20s/h、置于磁架上，静置20s,弃上清。i、重复步骤g-h一次，并尽量除去所有液体。j、置于磁力架上开盖干燥7-8min，用枪吸弃所有的液体。k、加入50ulElutionBuffer或ddH2O,旋涡震荡混匀磁珠15s。l、65℃，7min(期间旋涡震荡一次，震荡10s)。旋涡震荡混匀磁珠15s。m、置于磁力架上，静置2min，吸上清于收集管中。(2)提取后的DNA送往测序公司进行建库测序，获得测序数据后进行后续生物信息分析，得到菌群结果。三、不同的保存方式，样品菌群多样性比较经过上述实验操作，获得了3位志愿者9种处理方式下的肠道菌群序列信息，通过生物信息学分析，计算菌群香农多样性指数，进行比较。如表1所示，表中香本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粪便微生物样品DNA保存液，其特征在于：其中溶解有0.15‑0.35mol/L的乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、以及质量分数为12‑28％的二甲基亚砜，并调节pH至6.0‑9.0。

【技术特征摘要】
1.一种粪便微生物样品DNA保存液，其特征在于：其中溶解有0.15-0.35mol/L的乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、以及质量分数为12-28％的二甲基亚砜，并调节pH至6.0-9.0。2.根据权利要求1所述的一种粪便微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述保存液中溶解有0.2-0.3mol/L的乙二胺四乙酸二钠。3.根据权利要求2所述的一种粪便微生物样品DNA保存液，其特征在于：所述保存液中溶解有0.25mol/L的乙二胺四乙酸二钠。4.根据权利要求1所述的一种粪便微生物样品DNA保...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永亮，
申请(专利权)人：苏州普瑞森基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32