本发明专利技术提供了一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法。本发明专利技术利用分子标记来进行个体鉴定，通过提取鱼类鳞片DNA，筛选微卫星引物，多重PCR扩增，Cervus软件分析微卫星标记等步骤鉴定出放流的个体，准确率达到99.99%。该方法具有不损伤鱼体，操作性强，准确率高等优点。通过本方法建立的一套操作流程，可应用于鱼类的增殖放流效果评估研究中。
【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物及鉴别方法。
技术介绍
增殖放流指用人工方式向海洋、江河、湖泊等公共水域放流水生生物苗种或亲体的活动。对于濒危物种，通过增殖放流不仅可以补充和恢复生物资源的群体，保护濒危物种、增加渔业资源产量和修复生态环境，还具有培养渔民环保意识和增加渔民收入等多方面的重要意义。在增殖放流过程中，通常通过体外标志法或体内标志方法跟踪增殖放流的鱼类。体外标志法主要包括剪鳍法、烙印法、挂牌法等。该方法操作简单、易于识别，不需要专门的仪器，但可能会影响鱼类行为活动、易脱落，所以准确率不高。体内标志法主要包括线码标志法、档案式标志法、被动式整合雷达标志法和分离式卫星标志法等。该方法几乎不影响鱼类的生长，也不会遗失，准确率高于体外标志，但费用比较昂贵。近年来，微卫星分子标记作为一种新型的标志方法，已在国内外开始逐步试用。与传统标志方法相比，分子标记技术是以个体间遗传物质为基础的遗传标记，不存在脱落或改变的情况，最大程度减少了传统标志方法对鱼体造成的伤害，适用于鱼类的放流活动。微卫星，亦称简单重复序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)，一般为2～6个碱基单元重复，如(CA)n、(CAA)n、(GACA)n。微卫星DNA作为一种分子标记，具有分布广且均匀、多态信息含量高、共显性遗传等特点，已被广泛应用于群体遗传研究、生物遗传作图、个体鉴定以及亲子鉴定等方面。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术的目的是提供一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物及鉴别方法，采用本专利技术的鉴别方法可准确的鉴定出渔获物中哪些是放流的个体，为鱼类的增殖放流效果评估提供依据，准确率能达到99.99％，可应用于鱼类的增殖放流效果评估研究中。技术方案：一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，包括有用于扩增的15对微卫星引物，其序列如下：F1SEQIDNO.1～2、F2SEQIDNO.3～4、F3SEQIDNO.5～6、F4SEQIDNO.7～8、F5SEQIDNO.9～10、F6SEQIDNO.11～12、F7SEQIDNO.13～14、F8SEQIDNO.15～16、F9SEQIDNO.17～18、F10SEQIDNO.19～20、F11SEQIDNO.21～22、F12SEQIDNO.23～24、F13SEQIDNO.25～26、F14SEQIDNO.27～28、F15SEQIDNO.29～30。所述的每对引物对中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。每对引物进行标记时是采用PET、6FAM、NED和VIC中的任意一种进行染色。所述的引物对是经过分组的。具体分组为：F1、F2、F3、F4、F5为第一组；F6、F7、F8、F9、F10为第二组；F11、F12、F13、F14、F15为第三组。根据本专利技术的另一个方面，还提供了包含有上述引物组的检测试剂盒。所述的试剂盒由如下组成：DNA模板，2×TaqPCRMix，正向和反向引物，去离子水。根据本专利技术的另一个方面，还提供了上述试剂盒用于鉴定鱼类增殖放流个体的方法，包括以下步骤：步骤1，在放流前收集放流鱼类的鳞片样本、在调查水域采集和放流品种一致的鱼类鳞片样本，提取两种来源样本的基因组DNA；步骤2，以步骤1得到的DNA为模板进行PCR扩增；步骤3，运用Cervus软件分析两种来源的鱼类微卫星标记，鉴定得到调查水域采集的鱼类增殖放流个体。所述的鉴定鱼类增殖放流个体的方法中，步骤2中PCR扩增体系为：PCR反应总体积为15μL，其中16.6ng/μLDNA模板2μL，2×TaqPCRMix5μL，10μmol/L正向和反向引物各0.5μL，去离子水7μL。有益效果：本专利技术利用分子标记来进行个体鉴定，通过提取鱼类鳞片DNA，筛选微卫星引物，多重PCR扩增，Cervus软件分析微卫星标记等步骤鉴定出放流的个体，准确率达到99.99％。该方法具有不损伤鱼体，操作性强，准确率高等优点。通过本方法建立的一套操作流程，可应用于鱼类的增殖放流效果评估研究中。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例11.用磁珠富集法开发微卫星标记，筛选出扩增效率好，多态性高的引物。取15对微卫星引物，用PET6，FAM，NED和VIC等不同荧光标记引物，根据扩增片段大小及标记的荧光构成三组多重PCR，建立稳定的PCR反应体系。其中Multiplex1含有5对PCR引物，Multiplex2含有5对PCR引物，Multiplex3含有5对PCR引物，见表1。在三组多重PCR中，每对引物的浓度均一致。表1扩增的微卫星引物及其荧光标记引物名称荧光标记引物序列(5’-3’)多重PCRF1-FPETCGTAATGGAAGTCAGTGGACTGGMultiplex1F1-RCTGATTTAGCTTTTTAGTGCCCAATGCF2-FNEDTTATTATCCAAAGGGGTCAAAAMultiplex1F2-RGAGGTCGCTGGGGTTTACTATF3-FPETCTTTACAAATAGACAGACTMultiplex1F3-RGTCATACAGTCACTATCATCF4-FNEDCCTTTTGACAGATTTAGGATTTCMultiplex1F4-RCAAACCAAACATACCTAAAGCCF5-F6FAMGGCCCAGACAGATAAACAAACACGCMultiplex1F5-RGCCAACAGCAGCATCTACACCCAGF6-FNEDTTGTGAAGGGGCTGACTAACMultiplex2F6-RTCAATTGTTGGGTGCACATAGF7-F6FAMCTTGGAATATCTAGAATATGGCMultiplex2F7-RGTTCATGTGTTAATGTTGCGTGF8-FPETCTTGGTCCCGTTCTTACGACAACCMultiplex2F8-RTGCACGCTGCTTGGTCCTTGF9-FPETTTAGATGGTGGGATACTGGGAGGCMultiplex2F9-RCGGGAGCCCCATAACCCTACTAATAACF10-FNEDATCGAAATGGAACTTTTGAATGMultiplex2F10-RGCTTAGGGCTGAGAGAGGAATACF11-FPETTGGCAGGGATTTGACATAACMultiplex3F11-RGGGTTGAGTAGGGAGGCTTGF12-FNEDTCGCTGTGTATCAGTATTTTGGMultiplex3F12-RACTCGGATAACACTCACAGGTCF13-F6FAMTGTGGATTTTTGTATTATGTTAMultiplex3F13-RATACATTTCCTCCTCATTCAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：包括有用于扩增的15对微卫星引物，其序列如下：F1 SEQ ID NO.1～2、F2 SEQ ID NO.3～4、F3 SEQ ID NO.5～6、F4 SEQ ID NO.7～8、F5 SEQ ID NO.9～10、F6 SEQ ID NO.11～12、F7 SEQ ID NO.13～14、F8 SEQ ID NO.15～16、F9 SEQ ID NO.17～18、F10 SEQ ID NO.19～20、F11 SEQ ID NO.21～22、F12 SEQ ID NO.23～24、F13 SEQ ID NO.25～26、F14 SEQ ID NO.27～28、F15 SEQ ID NO.29～30。
【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：包括有用于扩增的15对微卫星引物，其序列如下：F1SEQIDNO.1～2、F2SEQIDNO.3～4、F3SEQIDNO.5～6、F4SEQIDNO.7～8、F5SEQIDNO.9～10、F6SEQIDNO.11～12、F7SEQIDNO.13～14、F8SEQIDNO.15～16、F9SEQIDNO.17～18、F10SEQIDNO.19～20、F11SEQIDNO.21～22、F12SEQIDNO.23～24、F13SEQIDNO.25～26、F14SEQIDNO.27～28、F15SEQIDNO.29～30。2.根据权利要求1所述的用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：所述的每对引物对中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。3.根据权利要求2所述的用于鉴定鱼类增殖放流个体的引物，其特征在于：每对引物进行标记时是采用PET、6FAM、NED和VIC中的任意一种进...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐永凯，俞菊华，李建林，李红霞，于凡，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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