一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法技术

本发明专利技术公开一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，先菌种活化、种子培养、发酵培养、细胞收集、细胞破壁，再脂多糖提取。本发明专利技术从土壤中筛选得到的粘质沙雷氏菌(

【技术实现步骤摘要】
一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法
本专利技术涉及微生物制剂的
，尤其是一种利用一株条件产色素的粘质沙雷氏菌NS-17生产具有抑菌活性脂多糖的生产工艺。
技术介绍
粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)是革兰氏阴性细菌，可用于生产两种重要的生物活性物质：灵菌红素和灵杆菌多糖。灵菌红素是一种正处于临床试验阶段的新型抗肿瘤药物；而灵杆菌多糖是一种具有升高白细胞、提高机体特异性免疫、抑肿瘤、抗感染等生物活性的脂多糖，临床主要用于各种原因引起的白细胞减少症、乙型肝炎及急慢性盆腔炎等疾病的辅助治疗。目前市场上的灵杆菌多糖产品均为注射用针剂，用于升高白细胞，提高机体免疫力，而没有专门用于抑菌的产品，鉴于灵杆菌多糖良好的生物安全性，开发具有显著抑菌效果的灵杆菌多糖对抗菌药物研发、食品防腐等领域具有重要意义。此外，目前用于灵杆菌多糖生产的粘质沙雷氏菌多不产色素（灵菌红素），以避免增加色素去除的工艺步骤，保持较高的收率，保障产品质量。但有研究表明，临床分离的菌株多不产色素，产色素菌株多从环境中分离得到，表明粘质沙雷氏菌的致病性与其是否产色素有一定的关联，使用产色素的粘质沙雷氏菌生产灵杆菌多糖具有较高的生物安全性，环境污染威胁较小，但存在生产工艺复杂，收率低，成本高等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，是利用条件性产色素的粘质沙雷氏菌生产具有抑菌效果的灵杆菌多糖的方法，该灵杆菌多糖对多种微生物尤其是金黄色葡萄球菌有显著的抑制效果。为了达成上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其步骤是：步骤1、菌种活化；取4℃保藏的斜面菌种粘质沙雷氏菌NS-17菌株接种于营养琼脂（牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L；pH7.0-7.2）斜面，37±0.5℃培养24h；步骤2、种子培养；步骤1的37℃活化培养24h的斜面菌种接种至液体种子培养基（甘油4g/L，蛋白胨16g/L，NaCl3g/L，KCl4g/L；pH7.0），接种前，种子培养基于40℃培养箱或水浴锅保温，接种时应尽量缩短操作时间，避免培养基冷却；使用250mL锥形瓶装液50mL或500mL锥形瓶装液100mL或1L锥形瓶装液200mL或3L锥形瓶装液600mL；接种后于37℃，200rpm下培养16h，得种子液；步骤3、发酵培养；发酵罐中按罐容积的70%装液量装入发酵培养基（麦芽糖6g/L，蛋白胨12g/L，NaCl1g/L，KCl2g/L，pH7.5），121℃蒸汽灭菌20min，冷却至37℃接种培养基体积的3%～6%的步骤2种子液，37℃培养，根据溶氧控制搅拌转速与通气量，初始通气量为0.5V/V·min，5L或10L罐初始搅拌转速为200rpm，50L以上发酵罐带变速时初始搅拌速度为100rpm，随溶氧的降低交替加大通气量与搅拌转速，控制溶氧大于25%，最大通气量为1V/V·min，控制发酵液pH为7.5±0.5；步骤4、细胞收集；发酵培养32h后迅速离心收集细胞，干冰非接触式迅速降温至5℃；步骤5、细胞破壁；取降温后的菌泥按质量/体积比（W/V）1:3的比例加入蒸馏水，混合均匀后循环流过80℃/-20℃高低温管，5个循环后完成破壁；步骤6、脂多糖提取；破壁后的菌液加入等体积的质量百分比浓度（W/W）为45%的苯酚水溶液，混合搅拌10min后再加入等体积的质量百分比浓度（W/W）为95%的苯酚水溶液，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相；70℃减压蒸馏浓缩后再次加入等体积的质量百分比浓度（W/W）为45%的苯酚水溶液，重复上述步骤，二次减压蒸馏浓缩液降温后，加入5倍浓缩体积的冰乙醇沉淀，6h后离心收集沉淀，先后用体积百分比浓度为（V/V）80%的乙醇、体积百分比浓度为（V/V）90%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤后真空冷冻干燥得到脂多糖。本专利技术的关键在于：1.全程严格控制温度，避免细胞在20-33℃之间的温度存活从而产生色素；2.高低温管循环破壁；3.本步骤的提取工艺。采用上述方案后，本专利技术从土壤中筛选得到的粘质沙雷氏菌(SerratiamarcescensNS-17)在30℃培养时产色素灵菌红素，在37℃培养时不产灵菌红素，得到的细胞不含色素。本专利技术通过严格控制培养温度，使用简单培养基，32h培养后离心收集菌体，反复冻融法破壁后用酚水法提取多糖，乙醇沉淀后用梯度浓度乙醇和丙酮洗涤，随后真空冷冻干燥得到具有显著抑菌活性的脂多糖。本专利技术的有益效果是：一、提供了一种具有显著抑菌活性的灵杆菌多糖的生产工艺，工艺流畅，切实可行，所得到的脂多糖具有广谱抗菌效果，尤其是对金黄色葡萄球菌具有显著抑制效果；二、去除了脱色素的步骤，通过严格控制培养温度，使条件产色素的菌株NS-17不产色素，简化了提取工艺，有利于降低生产成本。三、细胞破壁时使用高低温管循环破壁法，效果好、成本低、速度快。附图说明图1为SerratiamarcescensNS-17破壁细胞抑菌圈，其中受试菌为金黄色葡萄球菌，平板中间固体为SerratiamarcescensNS-17细胞破壁后的离心沉淀物；图2为脂多糖水溶液抑菌效果，其中受试菌为金黄色葡萄球菌，1#牛津杯中为0.5mg/mL的脂多糖水溶液；2#牛津杯中为蒸馏水；3#牛津杯中为1mg/mL的脂多糖水溶液；4#牛津杯中为1mg/mL的糊精水溶液，其中糊精经二次苯酚水提取、醇沉、梯度乙醇与丙酮洗涤、真空冷冻干燥，以排除操作中污染物造成的干扰。具体实施方式本专利技术严格控制培养温度在37±0.5℃，SerratiamarcescensNS-17经液体通气深层发酵后32h后快速离心收集细胞，通过高低温管循环破壁后利用酚水法提取脂多糖，所得到的脂多糖水溶液经减压蒸馏浓缩后用酚水法再次提纯，初步纯化后的脂多糖水溶液加入冰乙醇沉淀，沉淀用梯度浓度乙醇和丙酮洗涤后真空冷冻干燥得到脂多糖，所得的脂多糖具有广谱抗菌效果，尤其是对金黄色葡萄球菌具有显著抑制效果。其中：培养过程中，包括斜面活化、种子培养与发酵过程中均严格控制培养温度在37±0.5℃，所得到的细胞不产色素，产品纯化操作简单易行。离心收集的细胞通过高低温管循环破壁，使用原理为冻融法破壁，但和常规的冻融法不同，采用高低温管循环破壁法，处理量大，效果好，处理时间短，适合于除酶以外的生物活性产品的工业生产。得到的脂多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、酿酒酵母和黑曲霉均具有抑制效果，尤其是对金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著。实施例一：5L发酵罐生产灵杆菌多糖。取4℃保藏的斜面菌种接种于营养琼脂斜面，37℃培养24h后迅速接种至液体种子培养基，接种前，种子培养基于40℃培养箱保温。使用250mL锥形瓶装液50mL。接种后于37℃，200rpm下培养16h。经检测合格的种子液接种至5L发酵罐中，灭菌前发酵罐装液量为3.2L，121℃蒸汽灭菌20min，冷却至37℃接种100mL种子液，37℃培养，初始通气量为100L/h，初始搅拌转速为200rpm，随溶氧的降低交替加大通气量与搅拌转速，最大通气量为210L/h，最大搅拌速度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用粘质沙雷氏菌NS‑17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其特征在于步骤是：步骤1、菌种活化；取4℃保藏的斜面菌种粘质沙雷氏菌NS‑17菌株接种于营养琼脂斜面，37±0.5℃培养24h；步骤2、种子培养；步骤1的37℃活化培养24h的斜面菌种接种至液体种子培养基，接种前，种子培养基于40℃培养箱或水浴锅保温，接种后于37℃，200rpm下培养16h，得种子液；步骤3、发酵培养；发酵罐中按罐容积的70%装液量装入发酵培养基，121℃蒸汽灭菌20min，冷却至37℃接种培养基体积的3%～6%的步骤2种子液，37℃培养，控制搅拌转速与通气量，使溶解氧不低于25%，控制发酵液pH为7.5±0.5；步骤4、细胞收集；发酵培养32h后迅速离心收集细胞，干冰非接触式迅速降温至5±5℃；步骤5、细胞破壁；取降温后的菌泥按质量/体积比W/V1:3的比例加入蒸馏水，混合均匀后循环流过80℃/‑20℃高低温管，5个循环后完成破壁；步骤6、脂多糖提取；破壁后的菌液加入等体积的质量百分比浓度W/W为45%的苯酚水溶液，混合搅拌10min后再加入等体积的质量百分比浓度W/W为95%的苯酚水溶液，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相；70℃减压蒸馏浓缩后再次加入等体积的质量百分比浓度W/W为45%的苯酚水溶液，重复上述步骤，二次减压蒸馏浓缩液降温后，加入5倍浓缩体积的冰乙醇沉淀，6h后离心收集沉淀，先后用体积百分比浓度为V/V80%的乙醇、体积百分比浓度为V/V90%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤后真空冷冻干燥得到脂多糖。...

【技术特征摘要】
1.一种利用粘质沙雷氏菌NS-17菌株生产抑菌活性脂多糖的方法，其特征在于步骤是：步骤1、菌种活化；取4℃保藏的斜面菌种粘质沙雷氏菌NS-17菌株接种于营养琼脂斜面，37±0.5℃培养24h；步骤2、种子培养；步骤1的37℃活化培养24h的斜面菌种接种至液体种子培养基，接种前，种子培养基于40℃培养箱或水浴锅保温，接种后于37℃，200rpm下培养16h，得种子液；步骤3、发酵培养；发酵罐中按罐容积的70%装液量装入发酵培养基，121℃蒸汽灭菌20min，冷却至37℃接种培养基体积的3%～6%的步骤2种子液，37℃培养，控制搅拌转速与通气量，使溶解氧不低于25%，控制发酵液pH为7.5±0.5；步骤4、细胞收集；发酵培养32h后迅速离心收集细胞，干冰非接触式迅速降温至5±5℃；步骤5、细胞破壁；取降温后的菌泥按质量/体积比W/V1:3的比例加入蒸馏水，混合均匀后循环流过80℃/-20℃高低温管，5个循环后完成破壁；步骤6、脂多糖提取；破壁后的菌液加入等体积的质量百分比浓度W/W为45%的苯酚水溶液，混合搅拌10min后再加入等体积的质量百分比浓度W/W为95%的苯酚水溶液，60℃下搅拌1h，离心收集上层水相；70℃减压蒸馏浓缩后再次加入等体积的质量百分比浓度W/W为45%的苯酚水溶液，重复上述步骤，二次减压蒸馏浓缩液降温后，加入5...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅奇，肖玉娟，庄峙厦，黄华斌，郝春丽，
申请(专利权)人：厦门华厦学院，
类型：发明
国别省市：福建,35