DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用技术

本发明专利技术属于基于工程技术领域,具体涉及一种DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用。针对现有的DypB蛋白在异源表达时没有活性，需要体外结合血红素才能产生活性的问题，本发明专利技术提供一种DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用。本发明专利技术先通过基因重组，将表达血红素的相关基因整合到宿主细胞中，使宿主存在高浓度的血红素，再将DypB构建成重组载体后，导入血红素高表达的表达宿主中，从而实现了DypB活性蛋白的异源高表达。本发明专利技术通过在表达宿主中整合血红素合成相关基因提高血红素体内积累浓度，然后通过冷诱导方式大量表达DypB，使DypB经宿主表达后具有了降解木质素的活性。

【技术实现步骤摘要】
DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用
本专利技术属于基于工程
,具体涉及一种DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用。
技术介绍
木质素是一种广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物。木质素属天然芳香族高分子聚合物,由苯基丙烷单元通过醚键(C-OC)和碳-碳键(C-C)连接聚合而成的复杂的、无定形的三维空间结构,依苯丙烷的侧链取代基不同,木质素又可以分为松柏醇(Coniferylalcohol)、香豆素(p-Coumarylalcoho1)和芥子醇(Sinapylalcoho1)等结构单元。这些结构单元存在多样性，重复单元间缺乏规律性和有序。自然界中，木质素几乎全部与纤维素伴生，木质素与半纤维素以共价键形式结合,将纤维素分子包埋在其中,一方面极大提高了纤维素在纤维垂直方向上的刚性，另一方面形成一种天然阻碍，使纤维素酶类不易与纤维素分子大面积作用，维持纤维素分子的稳定性。这也造成在纤维素酶解过程中由于酶作用方式受到木质素-纤维素紧密结构的影响不能同时多点消化底物，造成实际酶解效果相对迟滞，给纤维素水解造成内因性困难。由于木质素结构的复本文档来自技高网...

【技术保护点】
DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、构建表达宿主BL21‑AL构建表达框架，所述表达框架从5’到3’方向依次为tac启动子、核苷酸序列为Seq ID No.1的hemA基因、核苷酸序列为Seq ID No.2的hemL基因、thrA基因，插入到pET28a质粒上构建成pET28a‑hemAL；以质粒pkd3为模板，PCR扩增氯霉素抗性基因与两侧的FRT位点，添加E.coli thrA基因5′端同源臂，插入到pET28a‑hemAL，构建成pET28a‑hemAL‑Cm；将质粒pkd46转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建成大肠杆菌BL21‑46，再将pET28a‑h...

【技术特征摘要】
1.DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、构建表达宿主BL21-AL构建表达框架，所述表达框架从5’到3’方向依次为tac启动子、核苷酸序列为SeqIDNo.1的hemA基因、核苷酸序列为SeqIDNo.2的hemL基因、thrA基因，插入到pET28a质粒上构建成pET28a-hemAL；以质粒pkd3为模板，PCR扩增氯霉素抗性基因与两侧的FRT位点，添加E.colithrA基因5′端同源臂，插入到pET28a-hemAL，构建成pET28a-hemAL-Cm；将质粒pkd46转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建成大肠杆菌BL21-46，再将pET28a-hemAL-Cm导入到BL21-46，进行red重组后，导入质粒pCP20，敲除氯霉素抗性基因，构建成表达宿主BL21-AL；b、构建表达载体pCspA-dypB将核苷酸序列为SeqIDNo.3的DypB基因插入到pET28a载体中，构建pET28-dypB，以E.coli为模板，PCR扩增cspA基因启动子，插入到pET28-dypB中，构建成表达载体pCspA-dypB；c、DypB蛋白的表达与纯化将步骤b中的表达载体pCspA-dypB导入步骤a所述的表达宿主BL21-AL中，IPTG诱导表达，Ni亲和层析法进行纯化，得到高纯度的DypB活性蛋白。2.根据权利要求1所述的DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于：步骤a中所述表达框架的插入位点为BglⅡ和EcoRⅠ。3.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄非，田润，宋乐元，李谦，杨明辉，屈刚，
申请(专利权)人：四川爱奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51