一种从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法技术

本发明专利技术提供了一种从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法，其通过对链霉菌发酵的过滤、萃取除杂、活性炭过滤、大孔树脂吸附、解析、结晶及真空干燥得到丝裂霉素C，本发明专利技术所揭示的从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法具有操作程序简单、方法稳定、重现性好等优点，在工业化生产中具有极高的实用价值。

Method for extracting mitomycin C from Streptomyces fermentation liquid

The present invention provides a method for extraction of mitomycin C from Streptomyces fermentation broth by fermentation of Streptomyces, filtration, extraction and impurity removal, activated carbon filtration, macroporous resin adsorption and desorption, crystallization and vacuum drying to obtain mitomycin C, extraction method of mitomycin C from pronase fermentation broth in the with a simple and stable method, good repeatability, has high practical value in industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法
本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及一种从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法。
技术介绍
丝裂霉素C(MitomycinC，MMC)是从头状链霉菌(Streptomycescaespitosus)培养液中分离提取的一种广谱抗肿瘤抗生素，属醌类。丝裂霉素C的分子式为C15H18N4O5，分子量：334.33，丝裂霉素C的分子结构式如下式(1)所示。丝裂霉素C是蓝紫色有光泽结晶或结晶性粉末，易溶于N,N-二甲基乙酰胺，微溶于水、甲醇、乙醇、酮，在乙醚、苯甲酸苄酯中几乎不溶。其在酸、碱及日光下均不稳定，而晶体状态较为稳定，但在培养基中易被其自身产生菌中特定酶系降解。丝裂霉素C对多种癌细胞有抗癌作用，其作用机理主要是使细胞DNA解聚，同时阻碍DNA的复制，从而抑制肿瘤细胞分裂。临床上用于治疗包括消化道癌、肝癌、颈部肿瘤和慢性白血病在内的人体多种恶性肿瘤。目前，工业上通过发酵培养方法生产丝裂霉素C时，所产生的产物中丝裂霉素C的含量通常仅占约12％以下。有鉴于此，有必要对现有技术中的丝裂霉素C的提取方法予以改进，以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于揭示一种从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法，以降低制备丝裂霉素C的生产成本，并使其适于产业化应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法，包括以下步骤：步骤(1)、取链霉菌发酵液，加入助滤剂，并用碱液调节pH至7.0～9.0，搅拌30～120min，对链霉菌发酵液进行过滤，得澄清滤液；步骤(2)、将步骤(1)中所得的澄清滤液倒入分液漏斗中，加入乙酸乙酯，并缓慢加入缓冲溶液，振荡，取下层清液；步骤(3)、将步骤(2)中所得的下层清液倒入烧杯中，加入活性炭，搅拌30～60min，过滤芯，得滤液；步骤(4)、将步骤(3)中所得的滤液使用装填大孔树脂的树脂床层进行吸附，并使用去离子水进行洗脱，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，然后用有机溶剂进行解析，收集解析液；步骤(5)、将步骤(4)中所得的解析液进行浓缩，得浓缩液，向浓缩液加入有机溶剂进行结晶，得晶体；步骤(6)、将步骤(5)中所得的晶体用真空干燥箱进行干燥。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(1)中的助滤剂的添加量为1wt％～5wt％，所述助滤剂选自硅藻土或珍珠岩。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(1)中的碱液选自氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，所述碱液的浓度为1～5mol/L。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(2)中的乙酸乙酯与澄清滤液添加的体积比为0.5～1.5:1；所述缓冲溶液由0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.2mol/L的磷酸二氢钠构成，所述缓冲溶液的pH呈7～8。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(3)中的活性炭的添加量为2wt％～10wt％；所述滤芯的精度为0.22μm～0.65μm。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(4)中的大孔树脂选自D1300数据、X-5树脂或者HP20树脂；所述步骤(4)中的有机溶剂选自甲醇或者丙酮。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(5)中的有机溶剂选自乙醚或者石油醚；所述浓缩液与有机溶剂混合的体积比为1:20～50。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(6)中真空干燥箱中的真空干燥温度为30～50℃，真空度为0.07～0.1MPa，干燥时间为8～18h。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术所示出的从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法具有操作程序简单、方法稳定、重现性好等优点，在工业化生产中具有极高的实用价值。具体实施方式下面结合各实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本专利技术的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本专利技术的保护范围之内。除非说明书中有特殊说明，本专利技术中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃。实施例一：该从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法包括以下步骤：步骤(1)、取链霉菌发酵液，向其中加入相当于链霉菌发酵液质量的0.5wt％的硅藻土作为助滤剂，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，搅拌30min，对链霉菌发酵液进行过滤，得澄清滤液。步骤(2)、将步骤(1)中所得的澄清滤液倒入分液漏斗中，向分液漏斗中加入乙酸乙酯。其中，乙酸乙酯与澄清滤液添加的体积比为0.5:1。然后，向分液漏斗中缓慢加入由0.2mol/L磷酸氢二钠和0.2mol/L磷酸二氢钠所组成的缓冲溶液，调节体系的pH至7.0，振荡，取下层清液。步骤(3)、将步骤(2)中所得的下层清液倒入烧杯中，向烧杯中加入2wt％的活性炭，搅拌30min，使用过滤精度为0.22μm的滤芯过滤杂质，得滤液。步骤(4)、将步骤(3)中所得的滤液转移至装填有型号为D1300的大孔树脂的树脂床层上进行吸附，并使用去离子水进行洗脱，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，之后用甲醇进行解析，收集解析液。步骤(5)、将步骤(4)中所得的解析液进行浓缩，得浓缩液，向浓缩液加入乙醚进行结晶，得晶体。其中，浓缩液与乙醚混合的体积比为1:20。步骤(6)、将步骤(5)中所得晶体放入真空干燥箱中，真空干燥温度为30℃，真空度为0.07MPa，干燥8h，得到蓝紫色结晶性粉末即终品丝裂霉素C。实施例二：该从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法包括以下步骤：步骤(1)、取链霉菌发酵液，向其中加入相当于链霉菌发酵液质量的5wt％的珍珠岩作为助滤剂，并用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，搅拌120min，对链霉菌发酵液进行过滤，得澄清滤液。步骤(2)、将步骤(1)中所得澄清滤液倒入分液漏斗中，向分液漏斗中加入乙酸乙酯。其中，乙酸乙酯与澄清滤液添加的体积比为1.5:1。然后。向分液漏斗中缓慢加入0.2mol/L磷酸氢二钠和0.2mol/L磷酸二氢钠所组成的缓冲溶液，调节体系的pH至8.0，振荡，取下层清液。步骤(3)、将步骤(2)中所得的下层清液倒入烧杯中，向烧杯中加入10wt％的活性炭，搅拌60min，使用过滤精度为0.65μm的滤芯过滤杂质，得滤液。步骤(4)、将步骤(3)中所得的滤液转移至装填有型号为X-5的大孔树脂的树脂床层上进行吸附，并使用去离子水进行洗脱，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，之后用丙酮进行解析，收集解析液。步骤(5)、将步骤(4)中所得的解析液进行浓缩，得浓缩液，向浓缩液加入石油醚进行结晶，得晶体。其中，浓缩液与石油醚混合的体积比为1:50。步骤(6)、将步骤(5)中所得的晶体放入真空干燥箱中，真空干燥温度为50℃，真空度为0.1MPa，干燥18h，得到蓝紫色结晶性粉末即终品丝裂霉素C。实施例三：该从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法包括以下步骤：步骤(1)、取链霉菌发酵液，向其中加入相当于链霉菌发酵液质量的3.0wt％的珍珠岩作为助滤剂，并用3mol/L的氢氧化钾溶液调节pH至7.5，搅拌60min，对链霉菌发酵液进行过滤，得澄清滤液。步骤(2)、将步骤(1)中所得的澄清滤液倒入分液漏斗中，向分液漏斗中加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)、取链霉菌发酵液，加入助滤剂，并用碱液调节pH至7.0～9.0，搅拌30～120min，对链霉菌发酵液进行过滤，得澄清滤液；步骤(2)、将步骤(1)中所得的澄清滤液倒入分液漏斗中，加入乙酸乙酯，并缓慢加入缓冲溶液，振荡，取下层清液；步骤(3)、将步骤(2)中所得的下层清液倒入烧杯中，加入活性炭，搅拌30～60min，过滤芯，得滤液；步骤(4)、将步骤(3)中所得的滤液使用装填大孔树脂的树脂床层进行吸附，并使用去离子水进行洗脱，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，然后用有机溶剂进行解析，收集解析液；步骤(5)、将步骤(4)中所得的解析液进行浓缩，得浓缩液，向浓缩液加入有机溶剂进行结晶，得晶体；步骤(6)、将步骤(5)中所得的晶体用真空干燥箱进行干燥。

【技术特征摘要】
1.一种从链霉菌发酵液中提取丝裂霉素C的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)、取链霉菌发酵液，加入助滤剂，并用碱液调节pH至7.0～9.0，搅拌30～120min，对链霉菌发酵液进行过滤，得澄清滤液；步骤(2)、将步骤(1)中所得的澄清滤液倒入分液漏斗中，加入乙酸乙酯，并缓慢加入缓冲溶液，振荡，取下层清液；步骤(3)、将步骤(2)中所得的下层清液倒入烧杯中，加入活性炭，搅拌30～60min，过滤芯，得滤液；步骤(4)、将步骤(3)中所得的滤液使用装填大孔树脂的树脂床层进行吸附，并使用去离子水进行洗脱，洗脱至洗脱液用紫外分光光度计没有检出峰为止，然后用有机溶剂进行解析，收集解析液；步骤(5)、将步骤(4)中所得的解析液进行浓缩，得浓缩液，向浓缩液加入有机溶剂进行结晶，得晶体；步骤(6)、将步骤(5)中所得的晶体用真空干燥箱进行干燥。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的助滤剂的添加量为1wt％～5wt％，所述助滤剂选自硅藻土或珍珠岩。3.根据权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹峥，付静，游云龙，杨亮，郑缘，成梁，
申请(专利权)人：无锡福祈制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32