本发明专利技术公开了一种促进人癌细胞发生凋亡的化合物及其应用。所述化合物是名称是2‑(4‑羟基苯胺)酚，该化合物能够与人的p53蛋白结合后，恢复突变型p53蛋白为野生型的构象，提高p53蛋白的转录活性，引起癌细胞发生凋亡，从而抑制细胞的增殖；本发明专利技术的化合物能够与人的p53蛋白结合，通过改变癌细胞中突变的p53蛋白转录活性而诱导癌细胞发生凋亡，为癌症的后续治疗提供一种新的思路。
Compound for promoting apoptosis of human cancer cells and application thereof
The invention discloses a compound for promoting apoptosis of human cancer cells and uses thereof. The compound is the name of 2 (4 hydroxy aniline phenol), the compound and the p53 protein binding after recovery of mutant p53 protein conformation to wild-type, enhance the transcription activity of p53 protein, induced cancer cell apoptosis, inhibit cell proliferation; the invention can compound the p53 binding protein, by changing the cancer cells in mutant p53 transcriptional activity and induce apoptosis in cancer cells, which provides a new idea for the subsequent treatment of cancer.
【技术实现步骤摘要】
一种促进人癌细胞发生凋亡的化合物及其应用
本专利技术涉及一种化合物，涉及了一种促进癌细胞发生凋亡的化合物及其应用，该化合物是通过改变癌细胞中突变的p53蛋白的转录活性而能够诱导癌细胞发生凋亡。
技术介绍
p53蛋白作为转录因子，是基因组的守卫者，当基因组发生损伤会激活p53蛋白的转录活性，从而引起细胞周期的阻滞和细胞的凋亡。据已有的统计发现，50％的人类癌症中p53均发生了点突变，从而影响了p53蛋白的功能。且有相关文献报道，突变的p53蛋白恢复活性能够显著的阻止癌症的发生和发展。传统的p53蛋白激活因子的筛选多是从细胞层面的筛选，通过构建p53蛋白缺陷的细胞系，然后从已有的化合物库中筛选出能够影响p53缺陷的细胞系的化合物，而该化合物不影响p53正常的细胞系。通过这种筛选方法，国外的一些研究机构已经发现了几种能够激活突变型p53蛋白的化合物。这些化合物中，有的是直接与突变的p53蛋白结合从而提高p53蛋白的稳定性而发挥功能，另一方面，有的化合物可以间接的通过改变与p53蛋白相互作用的蛋白而激活突变的p53蛋白。因为p53蛋白在癌症中发生突变的几率很大，所以找到能特异性与突变型p53蛋白结合并恢复其野生型的功能，对于癌症的治疗会提供一个有益的思路。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中的问题，本专利技术提出了一种促进癌细胞发生凋亡的化合物及其应用，本专利技术中该化合物通过激活突变的p53蛋白的转录活性，而促进了癌细胞发生凋亡，为癌症的治疗提供一种思路。本专利技术采用的技术方案是：一、一种促进癌细胞发生凋亡的化合物：所述化合物是2-(4-羟基苯胺)酚，其分子式如下：所述化合物具体采用以下方式合成：所述化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，分装后放置于-80℃冰箱中进行保存。所述化合物能够与人的p53蛋白结合后，恢复突变型p53蛋白为野生型的构象，引起癌细胞发生凋亡。二、化合物的应用是在抗癌和制备抗癌药物的应用。所述化合物能够与人的p53蛋白结合后，恢复突变型p53蛋白为野生型的构象，引起癌细胞发生凋亡，从而实现抗癌作用。所述化合物能抑制细胞增殖并促进细胞的凋亡，能够增加p53蛋白的转录活性。所述化合物能在体外与人的重组p53蛋白结合。所述的重组p53蛋白是谷胱甘肽转移酶(GST)为标签的融合蛋白。所述的重组p53蛋白采用以下方式进行构建：a)通过构建人的cDNA文库中，通过PCR扩增得到人p53基因并经过测序为野生型的p53基因，然后使用FastMutagenesisSystem试剂盒，获得在175位精氨酸突变为组氨酸和在220位酪氨酸突变为半胱氨酸的突变体p53基因；b)将步骤a)中获得野生型的p53基因和突变体p53基因均通过内切酶BamH1和Xho1双酶切后连接到原核表达的载体pGEX6p-2质粒上，然后转化到原核表达菌株BL21DE3中；c)将步骤b)中的原核表达菌株BL21DE3在37℃培养至OD600为0.6左右时，加入异丙基硫代半乳糖苷使其在培养液中的浓度为0.5mM，然后摇菌培养收集菌体，用磷酸盐缓冲液重悬细胞，超声破碎，离心后取上清液与Glutathionesepharose4FastFlow琼脂糖介质结合，4摄氏度孵育3个小时后，用30ml磷酸盐缓冲液清洗介质，再用10mM还原型谷胱甘肽洗脱，得到重组p53蛋白。本专利技术是将化合物重组的GST-p53蛋白与孵育后，通过葡聚糖凝胶层析柱sephadexG50填料后，收集流出G50葡聚糖凝胶柱280nm波长下的蛋白峰，蛋白会与化合物结合，并随着蛋白一起流出G50填料，以此来证明该化合物能与化合物在体外发生相互作用。具体地采用以下方式证明该化合物能够与重组的p53蛋白结合：用从原核表达系统得到的重组p53蛋白与该化合物在25℃温度下孵育1小时，以使蛋白与化合物能够充分的结合，然后将蛋白小分子复合物通过分子筛sephadexG50(葡聚糖凝胶G50，GEHealthcare，美国)，流出G50葡聚糖凝胶柱后收集蛋白峰，冻干后再用甲醇溶解，离心去除变性的蛋白后，取上清液的化合物，即为与重组p53蛋白结合的化合物。假定当该化合物与p53蛋白结合后，形成了蛋白小分子复合物，通过G50凝胶柱时，p53蛋白由于分子量远大于化合物，所以会早于化合物从G50柱子中流出，而p53蛋白如果与该化合物结合形成复合物后，会带着小分子化合物先从柱子中流出，因此需要收集280nm波长下蛋白峰，然后将其冻干，再用甲醇溶解，离心去除变性的蛋白后，上清中的化合物，用GC-MS(气相色谱质谱联用仪)进行鉴定，得到与重组p53蛋白结合的化合物。本专利技术实施通过有机合成获得该化合物纯品，并通过细胞实验验证该化合物的功能，通过MTS，Caspase3/7酶活测定，发现该化合物能够抑制细胞增殖并促进细胞的凋亡，通过AnnexiV/PI染色，流式细胞仪测定，发现该化合物确实通过凋亡来抑制癌细胞的增殖，然后通过构建含与p53结合的启动子的荧光素酶报告质粒，测定经化合物处理后荧光素酶的活性，从而得知该化合物能够增加p53的转录活性。本专利技术的有益效果是提供了一种能特异与p53蛋白结合进而恢复其野生型功能的化合物，通过激活突变的p53蛋白的转录活性，而促进了癌细胞发生凋亡，并且经实验验证该化合物能够抑制细胞增殖并促进细胞的凋亡，能够增加p53的转录活性。附图说明图1是用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)鉴定本专利技术化合物的质谱图。图2是用1H的NMR(核磁共振)鉴定本专利技术化合物的NMR(核磁共振)图。图3是实施例通过MTS实验测定A375细胞在不同浓度化合物处理后的细胞增殖情况示意图。图4是实施例获得不同的化合物浓度处理下，检测A375细胞的caspase3/7酶活数量情况图，在50uM和10uM下，细胞caspase3/7酶活增加，细胞发生凋亡。图5是实施例A375细胞分别在DMSO处理和本专利技术化合物处理后，用AnnexinV/PI法检测细胞凋亡情况的示意图。图6是实施例在不同浓度的化合物处理后，A375细胞通过westernblot检测细胞内p53蛋白的表达情况图。图7是实施例在不同浓度的化合物处理后，MDA-MB-435细胞通过westernblot检测细胞内p53蛋白的表达情况图。图8是实施例A375细胞在分别用DMSO和本专利技术化合物处理后再用单克隆抗体Pab1620处理后并荧光二抗标记后双光子激光共聚焦显微镜的结果图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术的实施例如下：1)构建重组GST-p53蛋白，采用GST标签进行标记：a)通过用Trizol法提取MCF-7细胞(一种乳腺癌细胞，p53蛋白为野生型)的RNA，然后用PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit(TAKRA，大连宝生生物)将RNA反转为单链的DNA，并以此单链DNA为模板，通过PCR扩增得到人的野生型的p53基因，然后使用FastMutagenesisSystem(Transgen,北京全式金生物技术有限公司)试剂盒，获得175位精氨酸(R)突变为组氨酸(H)，220位酪氨酸突变为半胱氨酸(C)的突变体p53基因，野生型和突变型的p53基因序列均通过测序验证；b)将步骤a)中获得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进癌细胞发生凋亡的化合物，其特征在于：所述化合物是2‑(4‑羟基苯胺)酚，其分子式如下：
【技术特征摘要】
1.一种促进癌细胞发生凋亡的化合物，其特征在于：所述化合物是2-(4-羟基苯胺)酚，其分子式如下：2.根据权利要求1所述的一种促进癌细胞发生凋亡的化合物，其特征在于：所述化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，分装后放置于-80℃冰箱中进行保存。3.根据权利要求1所述的一种促进癌细胞发生凋亡的化合物，其特征在于：所述化合物能够与人的p53蛋白结合后，恢复突变型p53蛋白为野生型的构象，引起癌细胞发生凋亡。4.根据权利要求1所述化合物的应用，其特征在于：是抗癌和制备抗癌药物的应用。5.根据权利要求4所述的化合物的应用，其特征在于：所述化合物能够与人的p53蛋白结合后，恢复突变型p53蛋白为野生型的构象，引起癌细胞发生凋亡，从而实现抗癌作用。6.根据权利要求4所述的化合物的应用，其特征在于：所述化合物能抑制细胞增殖并促进细胞的凋亡，能够增加p53蛋白的转录活性。7.根据权利要求1～4任一所述的化合物或者权利要求5～6任一所述的化合物的应用，其特征在于：所述化合物能在体外与人的重组p53蛋白结合。8.根据权利要求7所述的化合物或者化合物的应用，其特征在于：所述的重...
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓波，许晨曦，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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