本发明专利技术公开了一种促进癌细胞凋亡的ｓｈＲＮＡ，其碱基序列为５’－ＧＧＡＵＣＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＵＧＵＵＣＡＡＧＡＣＧＣＡＵＧＧＣＵＣＵＣＵＣＵＧＡＵＣＣ－３’。该ｓｈＲＮＡ针对的靶序列为ＡＡＧＧＡＵＣＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＵＧ。该ｓｈＲＮＡ通过下述ＤＮＡ寡核苷酸链之一转录生成，５’－ＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＴＧＧＣＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＣＣ－３’，或５’－ＧＧＡＴＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＧＴＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＣ－３’。这段ｓｈＲＮＡ能够通过ＲＮＡ干扰途径（ＲＮＡｉ），特异性降低人乳腺癌细胞系（ＭＣＦ－７）中一个非编码ＲＮＡ基因ＨＧＲＣ－１的表达，从而明显促进ＭＣＦ－７细胞的凋亡。在用途上，该发卡型小ＲＮＡ能用于诱导细胞凋亡，杀伤癌细胞，可以应用于抑制癌细胞增殖的药中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子遗传学领域，涉及一个能通过RNA干扰途径特异降 低细胞内^ferc-7基因表达量的发夹型小干扰RNA (命名为shHGRC-l) 的序列；以及利用这种发夹型小干扰RNA (shRNA)对餘2r-7基因进行 特异性干扰后引起细胞凋亡的作用，尤其是引起乳腺癌细胞系(MCF-7) 调亡的作用；本专利技术还涉及到该发夹型RNA在杀伤乳腺癌细胞、诱导癌 细胞凋亡方面的用途。
技术介绍
^^r-7基因是通过对某先天性静脉畸开肥大综合征(KTS)病例染 色体平衡易位点附近进行EST筛査时发现的一个新的非编码RNA基因， 在胎儿和成人的心、肝、脾等多种组织中均有持续广泛的表达。该基因 位于8号染色体长臂，全长873bp(见附图1)，经分析没有长的读码框， 是一个以RNA起作用的基因。该基因可能早期血管的发生与生成有关系， 可能会影响细胞的增殖与凋亡。RNA干扰技术(RNA interference,简称RNAi)是通过小分子双链 RNA (dsRNA)特异性互补耙向基因转录本，从而诱导基因转录后沉默的 一种技术。人工合成或细胞内转录生成的小的双链RNA (siRNA)或者 发夹型RNA (shRNA)进入细胞后，能和与之互补的靶基因信使RNA结合， 从而介导特异性的切割酶将信使RNA降解，达到降低目的基因表达的目 的。RNA干扰的效应的关键在于耙基因序列的选取，不同位点的选取， 其效果差异很大。这种高度序列特异性使其能够专一特异地降低某一基 因的表达。己证实，RNA干扰可单独或与其他现有的治疗手段一同用于 疾病的治疗，如抗病毒感染、肿瘤治疗等。(参考文献(l)Andrew Fire, at al，Potent and specificgenetic interference by double—strandedRNAin Cae/7ar/ aMz."51 e2e卵7 s, Nature 391, 806—811. (2) Carolyn Napoli, Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes // trans The Plant Cell, Vol. 2， 279-289，)
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种促进癌细胞凋亡的shRNA及其用途，该 shRNA能够促进癌细胞凋亡，本专利技术还提供了该shRNA的用途。本专利技术提供的一种促进癌细胞凋亡的shRNA，其特征在于，其碱基序列 如SEQ ID No. 1所示，即5' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC -3。该shRNA可以应用于抑制癌细胞增殖的药中。本专利技术提供了一种可以特异性抑制人^ferc-7基因表达的发夹型干扰 RNA (shHGRC-l)。该发夹型干扰RNA具有以下序列5' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC _3' (SEQ ID No. 1)针对耙序列 是Hgrc-lRNA序列中为AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG(SEQ ID No.2)的序列。本 专利技术还提供了编码该shRNA的DNA序列，以及包含该编码序列的质粒，利 用该质粒可以直接在细胞中，或者在体外生成shHGRC-l。本专利技术还证明了 该发夹型干扰RNA (shHGRC-1)在进入人乳腺癌细胞系中后，^ferc-7表达 量被降低，经流式细胞术PI单染检测细胞周期和细胞凋亡，并发现细胞凋 亡增加，细胞周期没有明显改变。这说明shHGRC-l在下调了乳腺癌细胞中 ^ferc-7基因的表达后，会癌细胞的凋亡，可以起到杀伤癌细胞的作用，具 有潜在的治疗癌症的价值。附图说明附图1显示i^rc-7基因的基因组结构和差异剪接方式；附图2显示通过RT-PCR验证人各种组织和不同细胞系中#5rc-7的表达，(a)为胃组织、脑组织和胃癌组织的表达，(b) MCF-7和HELA细胞 的表达，(c)主动脉、静脉和血细胞的表达，(d)胎儿心脏和肾脏等组 织的表达；附图3显示RNA干扰质粒的构建；附图4显示RNA干扰MCF-7细胞i^rc-7后其表达量(图中干扰质粒 子3为本专利技术中pGenesil-1- Hgrc-l质粒); 附图5对MCF-7细胞针对^ferc^基因进行RNA干扰后细胞凋亡情 况(图中干扰质粒子3为本专利技术中pGenesil-1- Hgrc-l质粒)。具体实施例方式vferc-7基因全长由华中科技大学人类基因组研究中心首先获得，该基 因的部分EST序列见Genebank中AI218163. 1， AI143880, 1， AI028191. 1， AI015296.1。本专利技术提供的通过RNA干扰途径能特异性降低细胞内Hgrc-1量的发夹 型RNA ( shRNA )，具有如SEQ ID No. 1所示序列5 ' -GGAUCAGACA GAGCCAUGUUCAAGACGCAUGGCUCUCUCU GAUCC -3'。更具体地，它针对的耙序 列是^rc-7基因RNA序列中为AAGGAUCAGACAGAGCCAAUG(如SEQ ID No. 2) 的序列。上述shRNA能通过下述二条DNA寡核苷酸链体外或体内转录生成 5' -GGATCAGACAGAGCCATGTTCAAGACGCATGGCTCTCTCTGATCC-3'(如SEQ ID No. 3)5 ' -GGATCAGAGAGAGCCATGCGTCTTGAACATGGCTCTGTCTGATCC-3 ' (SEQ ID No. 4。该序列是SEQ ID No.3所述核苷酸序列的互补链序列。包含上述SEQ ID No. 3和4所述DNA序列的质粒均能够在体内或者体 外通过转录生成如SEQ ID No. 1所述序列的RNA。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术，应说明，这些实施例仅 用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列事实例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring harbor Ubortory Press, 1989), 分子克隆实验室指南(第三版，科学出版社，2002)中所述的条件， 或按照生产厂商所建议的条件。实施例1RT-PCR检测)^rc-J基因在人不同组织以及几种人源性细胞系中的表达1、 RNA提取用Trizol(Irwitrogene)分别提取六月龄人胎心脏、肝、脾、肺、肾、 小肠、卵巢、软骨、主动脉、脐静脉、视网膜组织，以及成人主动脉、成 人血细胞、成人静脉、成人脑组织、正常胃组织、胃癌组织的总RNA，具体 步骤如下，50 —l 00mg组织加lmlTrizol ，匀浆后室温放置lOmin ，加 入0 . 2ml氯仿/ lmlTrizol ，剧烈震荡15秒，取上层水相移入一新的 EP管，加入0. 5ml/lmlTrizol异丙醇，室温放置15min，然后4。C12000g 离心本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进癌细胞凋亡的ｓｈＲＮＡ，其特征在于，其碱基序列如ＳＥＱＩＤＮｏ．１所示，即５’－ＧＧＡＵＣＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＵＧＵＵＣＡＡＧＡＣＧＣＡＵＧＧＣＵＣＵＣＵＣＵＧＡＵＣＣ－３’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘木根，王擎，刘静宇，徐承启，涂欣，任翔，柯铁，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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