本发明专利技术涉及一种从癌细胞或被病毒感染的细胞或重组细胞中生产和分离特异性免疫原性热休克蛋白的方法，以及从这种蛋白制备的疫苗。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种疫苗和生产这种疫苗的方法。
技术介绍
人类免疫应答的一个重要过程就是通过抗原呈递细胞(APCs)如巨噬细胞、B细胞或是树状细胞将抗原呈递到T细胞。外源抗原的片段与主要组织相容性(MHC)分子相连，与辅助分子，如CD4、CD8分子连接，从而展示在巨噬细胞的表面。以这种方式展示的“抗原片段”可以被T细胞的T细胞受体识别，通过T细胞受体与抗原的相互作用，从而激发抗原特异性的T细胞增殖和淋巴因子的分泌。由抗原呈递细胞(APCs)呈递的抗原片段的性质对于产生免疫性是非常关键的。热休克蛋白(HSP)来源于高度保守的蛋白家族，这个家族广泛分布于植物和动物界。根据分子量的差异，热休克蛋白可以分为六个家族小型(hsp 20-30Kda)、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90和hsp100。HSPs最早发现于处于热激状态的细胞，但是后来发现这类蛋白和多种形式的其它的外界作用力、刺激相关，例如感染，所以更通用的被称为“应激蛋白”(SPs)。哺乳动物hsp90家族的成员包括胞质hsp90(hsp83)和内质网胞质hsp90(hsp83),hsp87,Grp94(Erp99),gp97。详见Gething et al.(1992)Nature 355:33-45。Hsp70家族包括胞质hsp70(p73),hsp70(p72)，内质网胞质BiP(Grp78)和线粒体hsp70(Grp75)。哺乳动物hsp60家族的成员仅仅在线粒体中被发现。SPs在细胞中是普遍存在的，SPs的作用之一就是伴随着肽分子在细胞各部分之间进行输运，并且呈递到MHC分子处展示在免疫系统的细胞的表面。在患病细胞中，SPs同时还可以将病毒或是肿瘤相关的肽分子展示在细胞的表面。见Li,Sirivastave(1994)BehringInst.Mitt,94:37-47；Suzue et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:13146-51。伴随功能是通过SPs与蛋白或是SPs与病毒或肿瘤相关肽分子依赖ATP的反应而形成复合物这一过程而实现的。SPs与许多种类肽分子结合的反应都是需要ATP供能的。这些肽分子与复合物的性质至今仍不很清楚。SPs与多种肽分子的结合现象在正常组织中也被发现，也就是说这一现象并不是肿瘤特有的现象。见Sirvastava(1994)Experimentia 50:1054-60。例如，科学家曾在患者的人类慢性骨髓瘤白血病(CML)细胞的表面发现了hsp26,hsp60,hsp70和hsp90的表达，见Chant et al.(1995)Br.J.Haematol.90:163-8。在正常的、癌变前的和癌变的人类口腔粘膜细胞的表面都发现了hsp70的表达，见Kaur et al.(1998)Oral Oncol.34:93-8。通过将hsp70的表达和临床病理症状作比较，发现口腔粘膜上皮细胞发生异常变化与hsp70的表达有较大的相关性。在文献Ito et al.(1998)J.Oral.Pathol.Med.27:18-22中，科学家们检测了24份舌鳞片状细胞癌样品，发现虽然SP的免疫组化显示在肿瘤形成过程中SP的表达水平会发生变化，但是对其它的临床症状的研究(淋巴结转移，组织水平或是p53免疫染色)却并没有发现它们与SP相关。通常认为SPs的抗原性的作用并非来自于SPs本身，而是来自于复合物中与SP连接的肽分子。这个结论是基于大量关于复合物的性质所得。来源于正常细胞和肿瘤细胞中的SPs的分子结构没有差别。这样的肽分子和SPs结合成的复合物在用ATP处理后便失去了它们的免疫原性，见Udono et al.(1993)J.Exp.Med.178:1391-96。免疫原性的丧失的原因在于复合物中SP和肽分子发生了解离。在实际治疗中，曾有人提出使用SP-抗原复合物作为疫苗。特别在美国专利5,750,119中，Sirvastava公开了一种由多步组成，专门用于癌症患者的可以抑制哺乳动物肿瘤增殖的方法，大致步骤如下(a)去除肿瘤组织；(b)从肿瘤细胞中分离出所有的复合物；(c)将分离出的复合物重新导入哺乳动物体内，以激发肿瘤特异的免疫应答。通过逐条比较显示，Hsp70-肽、Hsp90-肽和gp96-肽复合物具有特异的疫苗的作用。不过，在Sirvastava公开的方法中，并没有分离出可以引起免疫应答的特异的肽分子或是特异的复合物。在WO 97/10000和WO 97/10001中显示，从癌细胞或是被病毒感染的细胞中抽提的热休克蛋白(HSPs)混合物可以激发对同源的肿瘤或是病毒抗原的保护性免疫反应或是产生相应的T淋巴细胞毒性。但是，从正常细胞中提取的HSPs却不能激发这样的免疫性反应。现在认为HSPs本身并不具有免疫原性，免疫原性是由与HSPs相连的肿瘤或是病毒特异的抗原肽分子。这些与HSPs相连的肽分子具有免疫原性，并且被呈递到T细胞。失去了肽分子的HSPs也失去了它的免疫原性(Udono,H.,Sirvastava P.K.:Journal ofExperimental Medicine,178,P1391 ff,1993)。至今，这些肽分子的性质仍然没有研究清楚。HSP的免疫性的产生要依靠吞噬细胞，例如巨噬细胞和其它的APCs。现在认为HSPs被巨噬细胞捕获，那些和HSPs相连的肽分子随之被呈递到巨噬细胞的MHC Ⅰ类分子上。这样，激发了一个T细胞的反应。使用HSP蛋白作为疫苗组分的方法在WO 95/24923和WO98/34641中被提及。从肿瘤细胞或是被病毒感染的细胞中分离出的HSPs被认为是可以呈递到T细胞的抗原性肽的来源。这样，就必须对这些细胞中的HSPs进行抽提和纯化。为了便于HSPs的纯化，对细胞通常可以作热激或是其它方式的刺激处理，以提高细胞内SPs的含量。但是现在科学家们还不能确定以这种方式诱导得到的SPs是否象本身表达出的HSPs一样可以和异源肽形成具有免疫原性的复合物。对细胞进行热激可以使得细胞中热休克蛋白的含量得到普遍的提高。理想状况是，刺激可以仅仅使得细胞的HSPs的一个亚类，即对于免疫原性有帮助的那一类，的含量显著提高。这样的HSPs亚类特别适合用于疫苗的生产。其它的刺激方式，例如渗透压、氧化或是重金属处理，都会诱导产生类型接近的HSPs混合物。现在，还没有一种方法可以通过刺激细胞仅仅使得细胞产生那些能够提高免疫原性的HSPs亚类。专利技术概述首先，本专利技术提供了一种生产疫苗的方法，步骤如下a)用细胞因子处理病毒感染的细胞、重组的细胞或癌细胞；b)从上一步被处理的细胞中抽提出热休克蛋白；c)使用抽提出的热休克蛋白制备疫苗。我们惊讶的发现，用细胞因子，尤其是α-干扰素处理被病毒感染的、重组的或是癌细胞后，所产生的HSPs的免疫原性比用热激方式处理上述细胞后所产生的HSPs的免疫原性更好。由细胞因子诱导的HSPs的亚型的免疫性和其它HSPs亚型相比，最显著的优点在于它具有长期的记忆效应。本文术语“疫苗”是指那些能够刺激免疫系统的组分，这样对于以后相似的感染，免疫系统可以起到更好的保护作用。疫苗一般包括免疫原性决定簇和可以提高免疫系统对决定簇应答的佐剂。优本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产疫苗的方法，包括如下步骤： ａ） 用足够诱导产生热休克相关应激蛋白的量的细胞因子处理被病毒感染的细胞、重组细胞或癌细胞； ｂ） 从处理后的细胞中抽提细胞因子诱导的热休克蛋白； ｃ） 使用抽提的热休克蛋白制备疫苗。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：卡米洛安东尼利奥塞尔温科拉克，苏珊娜玛利科拉克，
申请(专利权)人：免疫生物学有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]
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