一种具有强插膜能力的氨基酸多肽制造技术

本发明专利技术涉及一特定氨基酸序列的多肽，包含２２个氨基酸残基以下列顺序ＮＨ↓［２］－ＬＥＮＰＫＫＹＩＰＧＴＫＭＩＦＡＧＩＫＫＫＣ－ＣＯＯＨ（氨基酸的单字母符号表示）由氨基端向羧基端排列。其功能是很强的从水相自发插入含酸性磷脂的人工及天然细胞膜的能力，并可抑制细胞色素ｃ的前体脱辅基细胞色素ｃ与线粒体的结合，将该肽的以上特性应用于靶向药物的设计中，可将化合物或蛋白质通过共价结合或构建包含该序列的融合蛋白质使它们进入或穿越细胞膜到达作用位点。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学和蛋白质多肽
，与药物设计及药物合成密切相关。具体地说是利用化学合成法或基因工程方法制备22个氨基酸残基多肽，其序列源于鸡细胞色素c一级序列中的68-88部分，其氨基酸序列为NH2-LENPKKYIPGTKMIFAGIKKKC-COOH(氨基酸的单字母符号)。其特点是具有很强的自发插入人工或天然细胞膜的能力，而其氨基酸序列不同于已存在的具有插膜能力的多肽；另一方面，它可抑制细胞色素c(简称Cyt.c)前体脱辅基细胞色素c(简称apocyt.c)与线粒体的结合；该肽可直接作为以细胞内分子为靶点的功能药物，也可以利用该肽作为载体或靶向引导分子构建融合蛋白质或通过共价结合化合物制备出的药物可定位于或穿越细胞膜到达作用位点。二、技术背景本专利技术源于我们实验室对细胞色素c前体脱辅基细胞色素c的跨人工脂双层膜和线粒体外膜的研究。Apocyt.c是第一个被证明的、存在于细胞质中的线粒体前体蛋白，它由核基因编码在细胞质中的游离核糖体上合成后，跨过线粒体外膜在细胞色素c血红素裂解酶(CCHL)的催化作用下偶联血红素，形成完整的细胞色素c并定位于内膜的外侧，与线粒体内膜其它组分一起构成电子传递链，为细胞的新陈代谢提供能量。但是，Cyt.c的前体apocyt.c输入线粒体的分子机制特别是如何穿越外膜仍很不清楚，对此研究的重要性和目的在于1、Cyt.c为什么在进化过程中获得了既与其它膜间隙细胞色素蛋白(如Cyt.c1，Cyt.b2)截然不同的、也与原核和叶绿体体系中Cyt.c转运都不同的转运机制？2、Cyt.c从线粒体释放到胞浆中会引发细胞凋亡。作为电子传递中间体的Cyt.c在线粒体的能量产生与转化的过程中起不可缺少作用的、为什么在细胞程序性死亡(细胞凋亡)中也扮演重要角色？3、线粒体结构和功能的异常与许多疾病相关。自1988年致病性线粒体的核酸mtDNA突变第一次被鉴定出来之后，线粒体相关的疾病症候不断被报道出来，它们主要集中在神经、视觉系统和肌肉系统。临床表现为神经调节紊乱，运动失调，视网膜色素沉着，肌肉萎缩，心肌肥大等。现已发现脑脊髓炎(MELAS，MERRF， KSS/CPEO，NARP/MILS)、癫间、帕金森病(Parkinson′s disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、利伯氏病(Lebel′s disease)、母系遗传性糖尿病、耳聋(MIDD)以及进行性肾病和肝衰竭等，它们都与线粒体结构和功能变化有关。4、决定细胞色素c转运信号的研究及信号的发现对于控制细胞的生长、凋亡具有重要意义，据此原理设计的靶向药物对以上疾病的预防、治疗和抗癌药物的设计提供了一种新的方法。Apocyt.c输入线粒体的途径是所有线粒体蛋白质前体的跨膜转运中最特殊的。不同于其它大多数线粒体的前体蛋白，它不带有可剪切的N端导肽。输入线粒体不需要ATP、跨膜电位提供能量。至今尚未在线粒体外膜上发现有特异识别apocyt.c的受体或其它蛋白性成分参与其输入过程，也未明确脂在apocyt.c转运中的作用。Neupert等用基因融合的方法将细胞色素c1导肽部分中的导向基质部分信号序列接在去掉6个氨基酸的apocyt.c的N端，形成的杂交蛋白既可以像Cyt.c1一样进入基质，也可以像apocyt.c一样进入膜间隙，而且其进入基质不需要Cyt.c1的受体和GIP，表明apocyt.c的白发插膜能力可以绕过这一步骤，但需要一个跨内膜电势差。若将Cyt.c1的完整导肽接在apocyt.c的N端，得到的杂交蛋白就可以通过两条途径到达膜间隙，即Cyt.c途径或Cyt.c1的途径，即常规的保守定向从内外膜接触位点进入线粒体基质，经基质中的导肽酶处理后再插入内膜或内外模间隙。这一实验表明apocyt.c跨膜转运的特殊性在于线粒体的外膜上不存在apocyt.c的特异的受体；因此，apocyt.c高的膜表面活性可使它自发地插入线粒体的外膜替代大部分线粒体前体蛋白受体介导的跨越外膜自发地插入外膜，但是由于无法在线粒体水平检测apocyt.c插膜能力，所以，还没有直接的实验证据。另一个关键问题是apocyt.c序列中是否存在这样的片段，哪一部分的片段承担其高膜表面活性，该片段的位置、长度以及氨基酸序列特征是什么？该片段是否也负责apocyt.c对线粒体的识别和结合？ 用突变方法从apocyt.c中缺失掉一个片段28-39或61-66或72-86或两个片段28-39和72-86，并通过在大肠杆菌中表达和纯化步骤，我们获得了高度纯化的缺失突变体，对它们在脂质体上的转运研究结果显示在缺失的几个片段中只有72-86段的缺失会极大地降低apocyt.c的插膜及转运能力，提示这一段在apocyt.c跨脂双层转运中可能起决定性作用。为进一步确认，我们合成了一段含22个氨基酸残基的覆盖72-86片段的多肽，单分子层插膜、与脂质体、线粒体的结合能力以及对35S-apocyt.c与线粒体结合的竞争性抑制实验表明，此肽的插膜能力与完整蛋白相当，并可抑制apocyt.c与线粒体的结合。综合以上72-86片段缺失后apocyt.c在单分子层插膜、跨脂质体运送以及与线粒体结合的下降和化学合成的68-88肽段的功能替代表明apocyt.c中的68-88肽段起着关键作用，它是决定apocyt.c唯一的、独立的和最强的插膜片段，也是apocyt.c导向线粒体的内在信号肽之一。本专利技术的意义在于1、细胞色素c的进、出线粒体决定着细胞的生存和死亡。细胞新陈代谢所需的能量由线粒体提供，而Cyt.c是线粒体电子传递链上的重要组分之一，控制其前体的输入是调控线粒体功能的途径之一。2、很多药物的靶位点是细胞的胞质区或胞质内的细胞器，由于胞质被质膜包围，一些药物并不能自发跨越质膜屏障，因此，找出可引导特定药物穿越质膜的分子或化合物是靶向药物设计中的关键问题之一。我们合成的多肽具有高插膜能力并兼有对线粒体的结合能力，所以，存在很好的应用前景和经济效益。目前还没有发现利用我们发现的序列进行药物设计的报道。具体实施例方式1、含有本专利技术所设计的22个氨基酸、按NH2—LENPKKYIPGTKMIFAGIKKKC-COOH序列的多肽就具有含104个氨基酸残基的apocyt.c的插膜作用，并且具有很好的水溶性。一些天然的或人工合成的化合物包括多肽和蛋白质的插膜是许多生理现象和药物作用模型的分子基础，如蛋白质的跨膜运送，天然毒素(细菌、植物毒素等)的毒杀宿主，抗生素的杀菌等，但分子量一般均很大。2、本专利技术LENPKKYIPGTKMIFAGIKKKC的序列是具有插膜功能的最小长度之一，所以长于此长度的氨基酸序列同样具有相同的功能如在N端增加1至4个氨基酸残基。另一方面，由于本专利技术包括Cyt.c中最保守的10个氨基酸以外的序列，因此，对个别氨基酸残基的替换或保守替换不影响其功能，如本专利技术中的C端半胱氨酸残基(C)用丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)替换，谷氨酸(E)用谷氨酰胺(Q)或苏氨酸(T)替代。3、含有如上所述的22个氨基酸序列的多肽很容易利用化学合成法或基因工程法等获得。(1)固相或液相氨基酸化学合成法按NH2—LENPKKYIPGTKM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有强插膜能力的多肽，该多肽的氨基酸组成，由下式所示的单字母表示的氨基酸残基组成：ＮＨ↓［２］－ＬＥＮＰＫＫＹＩＰＧＴＫＭＩＦＡＧＩＫＫＫＣ－ＣＯＯＨ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩学海，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]