本发明专利技术为一种用于雏鹅小鹅瘟疾病的预防和治疗的蛋黄抗体的制备方法。它改变了使用母鹅进行高免用于制备抗小鹅瘟蛋黄抗体的先例，而改用鸭和鸡用于抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备，包括小鹅瘟种毒的制取，高免抗原的制取，蛋黄抗体的制取。经临床试验和使用结果表明：用本方法制备的异源小鹅瘟蛋黄抗体用于预防和治疗雏鹅小鹅瘟疾病，预防率和治愈率高、药效期长，药物效果显著，其预防率为９５％以上，早期治愈率达８０％以上。用该方法制成的高免抗体，成本明显低于同源的鹅蛋黄抗体和其它血清，且可预防由同源蛋黄抗体所致的垂直传播疾病的影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于预防和治疗小鹅瘟疾病的异源抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备方法与应用。
技术介绍
小鹅瘟病是由鹅细小病毒引起的主要侵害雏鹅的急性、败血性、接触性传染病。本病多发于3-7日龄的雏鹅，发病后往往为急性经过，发病率可达100％，死亡率高达60-80％。10-30龄以上的鹅也可感染发病，一般发病率不高，但一旦感染发病，则往往以死亡告终。本病给养鹅业造成了巨大的经济损失，是养鹅生产中危害最大的疫病。我国于1956年首次在扬州发现并确认本病。1965年以后，本病在世界各地迅速蔓延流行。由于10日龄以下仔鹅对小鹅瘟疫苗免疫不产生免疫应答，给小鹅瘟疾病的防制工作带来了很大的难度。通过国内外的分离毒株的血清学鉴定表明，从各地分离到的小鹅瘟毒株，抗原性基本相同，仅有一种血清型。基于这种原因，制备特异性的高免血清和高免蛋黄抗体预防和控制雏鹅小鹅瘟疾病，成为控制本病暴发流行的最经济有效的办法。80年代末，小鹅瘟高免抗血清和特异性蛋黄抗体制剂在我国开始广泛推广应用。由于蛋黄抗体疗效显著、制作方法简便，深受广大养殖户的欢迎。但在我国，均使用鹅源蛋黄抗体或家畜高免血清用于本病的防治。由于鹅产蛋率低，血清生产成本过高且有较高的过敏反应，因此鹅源蛋黄抗体或家畜高免血清用于本病的防治，在生产实际中有一定的推广难度。众所周知，在蛋黄存在着垂直传播的细菌、病毒污染。在我国推广应用的小鹅瘟高免蛋黄抗体均采用免疫产蛋鹅提取同源蛋黄抗体进行制备，某些垂直传播的疾病随着蛋黄抗体的大量应用迅速流行，给养鹅业造成了难以估量的损失。结合这种实际情况，我们使用免疫产蛋鸡或鸭的方法生产异源抗小鹅瘟高免蛋黄抗体，用于预防和治疗小鹅瘟，通过这种方式，有效的解决了生产实际中存在的上述问题。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供一种用于预防和治疗小鹅瘟疾病的异源抗小鹅瘟蛋黄抗体的制备方法与应用。使用异源动物鸡和鸭进行抗小鹅瘟蛋黄抗体的生产，主要是通过小鹅瘟灭活油乳剂疫苗加强免疫健康产蛋鸡和鸭，待蛋黄抗体效价合格后，收集高免蛋，从蛋黄中提取免疫球蛋白。用本方法生产的抗小鹅瘟蛋黄抗体，解决了本动物垂直传播疾病的危险和血清的高过敏原性，同时降低了生产成本和使用成本。根据本方法所制备的蛋黄抗体，用于预防和治疗小鹅瘟疾病，经临床试验证实，效果确实，与用常规方法生产的鹅的蛋黄抗体具有相同的治疗效果。在提取蛋黄抗体的过程中，蛋黄用3倍体积的生理盐水稀释后，充分搅拌均匀，用三氯甲烷进行提取精制，制备蛋黄抗体进行注射使用。在分离的上清液中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，37℃保温密封8-12小时，以杀灭蛋黄抗体中可能污染或垂直传播的微生物，从而确保产品的安全性。提取蛋黄抗体的性质稳定，可在室温下保存18个月以上，对于用户在运输、使用上具有独特的优势。具体实施例方式本方案主要包括以下步骤小鹅瘟种毒的制取及增殖、免疫抗原的制备、蛋鸡或蛋鸭的免疫、蛋黄抗体的提取。其具体方法为1、种毒准备及增殖1.1将冷冻保存的患小鹅瘟疾病死亡的小鹅肠道病料按照1∶5加灭菌生理捣碎，冻融2次后，形成混合组织悬液。1.2将混合组织悬液进行4000rpm离心，收集上清液。1.3取离心上清液，经56℃水浴处理30分钟，每毫升加入青霉素和链霉素1000单位，4℃处理2小时。1.4将青、链霉素处理后的种毒液用灭菌生理盐水稀释100倍，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，以0.1ml/只的剂量接种13-15日龄非免疫鹅胚尿囊腔，在37℃的恒温箱中孵育，弃去48小时内的死亡鹅胚，收集48-120小时内死亡的胚，置4-8℃冰箱保存过夜。1.5无菌采集尿囊液及羊水。死亡胚胚体应出现典型的肝脏出血、水肿以及尿囊膜水肿等病理变化。2、配制油乳剂抗原将收获的尿囊毒液中加入0.1％甲醛溶液，37℃密闭灭活48小时。期间每4-6小时振摇一次。灭活完成后，按灭活毒液96份，灭菌吐温-804份配制，即为制苗用抗原。同时按照常规方法制备油相。按油相3份、水相1份的比例进行乳化配制。即按比例取油相、水相搅拌均匀，加入高压均质机中，调节压力为35mpa，乳化制备成小鹅瘟灭活油乳剂疫苗。按量分装，加入1％硫柳汞溶液使之终浓度为万分之一，备用。按照油乳佐剂疫苗的相关检验项目进行检验，检验合格后，即为免疫用油乳剂抗原。置4℃避光保存，6个月内有效。3、产蛋鸡或鸭免疫3.1基础免疫以制备的小鹅瘟灭活油乳剂抗原颈部皮下注射0.5ml/只。3.2强化免疫2周后，以制备的小鹅瘟灭活油乳剂抗原颈部皮下注射1.0ml/只，进行强化免疫。间隔2周后用灭活油乳剂抗原再次强化免疫一次，颈部皮下注射2.0ml/只。3.3以后间隔8周进行一次强化免疫，每次颈部皮下注射2.0ml/只。4、小鹅瘟蛋黄抗体制备4.1高免蛋收集从第二次强化免疫后第7天开始，每隔三天抽样用琼脂扩散方法测定高免蛋黄中抗小鹅瘟特异抗体效价。蛋黄与生理盐水按1∶3(V/V)稀释后，加与蛋黄等体积三氯甲烷进行萃提，用琼扩方法检测萃提上清液中抗小鹅瘟特异抗体效价，若上清液琼扩抗体效价达到1∶64以上即可集蛋，用于制备小鹅瘟蛋黄抗体。高免蛋在15℃-25℃可贮存3天，4-10℃贮存期不得超过10天。4.2蛋壳消毒 将高免蛋浸入加热至42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟。蛋壳污染严重的，应事先选出，单独消毒并用清水冲洗干净后，再浸泡消毒一次。然后将新洁尔灭消毒后的高免蛋浸入水温为90-95℃的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。4.3蛋黄分离 采取手工或机械打蛋。打蛋时应充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。4.4萃提 于蛋黄中加入3倍体积的生理盐水，充分搅拌均匀，然后在蛋黄液中加入与蛋黄等体积的三氯甲烷，充分振荡混合均匀，室温作用60分钟，以3500-4000rpm离心30分钟，收集上层清液备用。4.5加入灭活剂 在分离的上清液中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，37℃保温密封8-12小时。4.6除菌过滤 用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，定量分装，即为抗小鹅瘟蛋黄抗体。5、产品检验5.1无菌检验 应无菌生长。5.2物理性状 本品为微黄色或淡黄色的透明液体。久置后瓶底有少许细小的白色沉淀。pH值5.5-6.5。5.3安全检验 18-22g健康小鼠5只，各皮下注射本品0.5ml；3日龄易感雏鹅10只，各皮下注射本品3.0ml。观察10天，小鼠和雏鹅均应全部健活。5.4抗体效价测定 琼扩抗体效价应达到1∶32及以上。5.5效力检验 用鹅效检 3-5日龄易感雏鹅30只，随机分为三组。第一组为健康对照组，不注射任何药品，隔离饲养。第二和三组每只雏鹅皮下接种小鹅瘟强毒SCG99株肠道病料毒lOOLD50。于攻毒后24小时分别给第二组皮下注射本品2.0ml，第三组皮下注射生理盐水2.0ml。观察每组雏鹅发病、死亡情况至第10天。结果判定第一组为健康对照组，试验期间全部雏鹅应健康无病。第三组为攻毒对照组，应于攻毒后3-7天发病，96小时后开始死亡，10天内应死亡8只以上。第二组为早期感染治疗组，注射本品后48小时，即攻毒后3天后，试验雏鹅开始发病，但发病率不得超过30％，至观察结束时试验雏鹅应存活8只及以上。该制品判为合格。使用油乳剂灭活本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗小鹅瘟异源蛋黄抗体制备方法，包括下列步骤：（ａ）将冷冻保存的患小鹅瘟疾病死亡的小鹅肠道病料按照１∶５加灭菌生理盐水捣碎，冻融２次后，形成混合组织悬液；将混合组织悬液进行４０００ｒｐｍ离心，收集上清液并于５６℃处理３０分钟，每毫升加入青霉素和链霉素１０００单位，４℃处理２小时；将青、链霉素处理后的种毒液用灭菌生理盐水稀释１００倍，经０．２２ｕｍ微孔滤膜过滤除菌，以０．１ｍｌ／只的剂量接种１３－１５日龄非免疫鹅胚尿囊腔，３７℃孵育，弃去４８小时内的死亡鹅胚，收集４８－１２０小时内死亡的胚；无菌采集尿囊液及羊水；（ｂ）将收获的尿囊毒液中加入０．１％甲醛溶液，３７℃密闭灭活４８小时；灭活完成后，按灭活毒液９６份，灭菌吐温－８０４份配制，即为制苗用抗原；按油相３份、水相１份的比例取油相、水相搅拌均匀，加入高压均质机中，调节压力为３５ｍｐａ，乳化制备成小鹅瘟灭活油乳剂疫苗，并加入１％硫柳汞溶液使之终浓度为万分之一；（ｃ）以制备的小鹅瘟灭活油乳剂抗原颈部皮下注射０．５ｍｌ／只；２周后，以制备的小鹅瘟灭活油乳剂抗原颈部皮下注射１．０ｍｌ／只，进行强化免疫；间隔２周后用灭活油乳剂抗原再次强化免疫一次，颈部皮下注射２．０ｍｌ／只；以后间隔８周进行一次强化免疫，每次颈部皮下注射２．０ｍｌ／只；（ｄ）从第二次强化免疫后第７天开始，每隔三天抽样用琼脂扩散方法测定高免蛋黄中抗小鹅瘟特异抗体效价；蛋黄与生理盐水按１∶３（Ｖ／Ｖ）稀释后，加与蛋黄等体积三氯甲烷进行萃提，用琼扩方法检测萃提上清液中抗小鹅瘟特异抗体效价，若上清液琼扩抗体效价达到１∶６４以上即可集蛋，用于制备小鹅瘟蛋黄抗体；（ｅ）将蛋壳消毒，打蛋并充分除去蛋清、胚盘和系带，收集蛋黄；于蛋黄中加入３倍体积的生理盐水，充分搅拌均匀，然后在蛋黄液中加入与蛋黄等体积的三氯甲烷，充分振荡混合均匀，室温作用６０分钟，以３５００－４０００ｒｐｍ离心３０分钟，收集上层清液备用；（ｆ）在分离的上清液中加入终浓度为０．０５％的甲醛溶液，充分搅拌混匀，３７℃保温密封８－１２小时；用０．２２μｍ微孔滤膜过滤除菌，即得琼扩抗体效价达到１∶３２及以上异源抗小鹅瘟蛋黄抗体。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何洪章，
申请(专利权)人：重庆永健生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：85[]
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