重组胶原样蛋白质的生产制造技术

本发明专利技术涉及用于生产重组胶原样蛋白质的酵母细胞。本发明专利技术还涉及用于生产该蛋白质的试剂盒或共表达系统，以及生产该重组蛋白及由其所制备的线的方法。此外，本发明专利技术涉及通过这些方法可得到的蛋白质或线以及它们在技术和医学的各个领域中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组胶原样蛋白质的生产 本专利技术涉及用于生产重组胶原样蛋白质的酵母细胞。本专利技术还涉及用于产生该蛋白质的试剂盒(kitofpart)或共表达系统，以及生产该重组蛋白及由该重 组蛋白所制备的线的方法。此外，本专利技术涉及通过这些方法得到的蛋白质或线 以及它们在技术和医学的各个领域中的用途。海生贝类存在于潮间带的端流场所中并且在这里，海生贝类已经十分成功 地定居在暴露于风和浪的岩石上。这种成功部分归因于独特的锚定作用，其中 海生贝类通过这种锚定作用将自身固定在岩石的固体表面上。这种锚定作用的 一部分是称作"足丝"或又称作"贝丝"的纤维结构。足丝为贝类提供必需的韧度 以通过与岩石或硬质表面连接而在波浪不断冲击下存活。贝类足丝完全由形成与细微腱类似的短线束的胞外基质构成。足丝线 显示不寻常的机械特性，因为它们在一端类似于软橡胶而在另一端类似于硬尼 龙并且这些特性以无缝及渐进过渡的方式存在。足丝线还是弹性的它们 能够承受剧烈变形而不破裂，并且在应力撤除时可以恢复至原始状态。在 远端，足丝线通过教性斑固定在岩石上。在近端，足丝线合并成锚定在贝足基 部的所谓足丝茎(见图3)。海生贝类的足丝线是具有巨大的吸收和散逸能量能力的弹性纤维。多达 70%的总吸收能量可以在足丝中散逸。在贻贝(M少"/船)物种(贝台贝(M e^fc)和 紫贻贝(M ga/qpraw'"c/afo))中，每条新线具有长度为数厘米以及直径小于O.l cm的尺度，并且通过与反应注射成型相似的过程在足的腹面沟中在大约5分 钟内形成。在形态学上，足丝分成4个部分(由近及远)根、茎、线和斑或腕趾。此 外，根据外观将线进一步分成近端部分和远端部分，即远端部分光滑坚硬并且 近端部分柔软纤弱，足丝线是弹性材料。杨氏模量低(在10-500 MPa的范围内)，延伸率可以 高达200。/。并且存在复原性恢复(restorative recall)。与其它蛋白质弹性体如弹性蛋白、节肢弹性蛋白和展肌蛋白(abductine)相同，足丝线相当坚韧。韧度和能 量散逸对于吸附器官均是重要性质。将进行循环应力-应变分析的纤维中的能 量散逸相对于总吸收能量进行归一化并报告为滞后或滞后百分数。已经将一条线的应力-应变循环分割成用于线的远端部分和近端部分的单 独的机械作用。如上所述的，在这些部分中，远端部分更粗壮、更坚硬并且在 緩冲作用方面性能优越，而近端部分更柔软及纤弱，具有较低但仍明显的滞后。足丝线的机械特性因时间及应变依赖行为而进一步复杂化。已经证实，当 受拉伸超出其屈服点时，远端部分表现示意性应力软化(schematic stress softening),即第二循环的初始模量减少至第一循环中模量(500-80 MPa)的约 20%。第一循环模量的完全恢复是緩慢的，例如超过24小时，但是明显恢复 可以在1小时内出现(初始值的30%)。近端部分也显示随循环载荷而改变劲度 的倾向。在此情况下，存在从35 MPa的初始模量至在50 MPa的渐近水平的 应变-变硬作用，增长约40%。MASCOLO和WAITE(1986)首先鉴定了 Mytilus足丝中的化学梯度。在用 胃蛋白酶处理足丝线后，鉴定了被称为ColP和ColD的两种抗胃蛋白酶的胶 原片段，其分别具有50kDa和60kDa的分子量。ColP可以主要在近端区域中 找到并且几乎不会在远端区域中找到。相反，ColD的量在远端部分增加至大 约100% (LUCAS等，2002; QIN和WAITE, 1995 )。在足丝线中以及在贝 足中，存在参与构建足丝线结构的另一种胶原样蛋白质。这种另外的蛋白质被 称为ColNG(NG =无梯度)，与ColD和ColP相反，它均匀分布在整条足丝线 中。它的生理学功能大概是作为其它两种线胶原的连接物(QIN和WAITE， 1998).胃蛋白酶切割的片段ColD和ColP源自所谓的前月交原P和D。来自贻贝 的前胶原(即D和P)都以共同的基础结构为特征两侧有不同侧翼区的中央胶 原螺旋，其中所述的侧翼区分别由富含组氨酸和DOPA的末端端接(见附图说明图1)。充分认识到胶原经交联发生稳定化；然而这种化学过程仍然未充分理解。存在 两种明显不同的交联可能性胶原单元间的金属络合及共价键形成。金 属络合作用由足丝中存在高水平的铁、铜、镍和锌以及在足丝蛋白质两个末端中存在结合金属的组氨酸丰富序列所提示。另外，DOPA出现在所有前胶原的 两个末端。肽基-DOPA提供优异的金属结合位点并且肽基-DOPA-Fe(III)螯合 物已经在海洋生物l占斑(marine adhesive plaque)mefp-l中报道。此外，已经 证实通过EDTA从足丝纤维中除去金属离子降低了纤维的屈服强度。也已经观 察到了共价交联。它们通常由酪氨酸、DOPA与半胱氨酸间的氧化偶联而形成。 在研究受高流量和高通气条件应激的足丝中，发现氧化的初级产物是5,5'-二 DOPA。没有发现其它可能的偶联产物如将赖氨酸Michael型加成至氧化的 DOPA 。如同"正常"胶原，每种贝类胶原具有确保将a-链运输至内质网中的20个 氨基酸的信号序列。在内质网中，三条相同的ct-链装配成同三聚体。ColD a-链(指胃蛋白酶切割的前胶原D)具有由SDS-PAGE确定的60kDa分子量和 由MALDI-TOF质i普确定的47 kD分子量(QIN等，1997)。 ColP a-链(指胃蛋 白酶切割的前胶原P)分别具有55kDa分子量(SDS-PAGE)和40 kD分子量 (MALDI-TOF)(COYNE等，1997)。 a-链的前体叫做前胶原D和前胶原P,分 别具有由SDS-PAGE分析所确定的95和97 kDa的分子量和通过用 MALDI-TOF质谱分析所确定的75和80 kD分子量(COYNE等，1997; QIN 等，1997)。两种胶原均具有对I-III型胶原典型的特征。两者均具有含量大于 34 %的甘氨酸并在胶原结构域中显示出合计20%的脯氨酸及羟脯氨酸含量。侧翼区完全对应于其它结构蛋白，即弹性蛋白(前胶原P)和丝纤蛋白(前胶 原D)。这种结构性构造解释了贝类足丝的机械行为。由于此原因，为了利用 这些异乎寻常的天然材料作为新技术学应用中的结构单元，重组地生产基础性 贝类足丝胶原将是极有意义的。开发具有所定义特征的材料、尤其是在应力或过载后能够自行恢复的材料 在材料科学中长时间以来具有高度的重要性。复合结构在技术学中引起了兴 趣，尤其对于电子元件和器件、换能器和其它材料。通过组合具有不同机械性 质的材料，将会形成引起新的技术问题的结构界面。因此，对于众多应用而言，极其需要提供渐变性结构，从而降低材料的整 体负荷。此外，贝类胶原在医学中的用途和应用引起极大的兴趣，原因在于高度的潜在生物相容性。基于这一点，可以产生具有高度免疫相容性的医用移植物和 组织。重组贝类胶原的生产是在可以构想贝类胶原的技术应用之前必须解决的 一个有趣而重要的技术问题。因此，本专利技术首要目的是提供这样的重组贝类足丝蛋白，其具有提高的特 性，如尤其是提高的以高产量表达的能力和优异强度及挠性。本专利技术的另一目足丝蛋白，其中它们基于所述的特定排列以提供渐变性结构。此外，本专利技术的 目的是提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酵母细胞，该酵母细胞用于生产重组胶原样蛋白质、优选用于生产重组贝类足丝蛋白，其中所述酵母细胞已经用以下元件转化：ａ）编码所述重组胶原样蛋白质的第一表达载体；和ｂ）包含编码脯氨酰－４－羟化酶（Ｐ４Ｈ）的核酸的第二表达载体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯沙伊贝尔，
申请(专利权)人：慕尼黑工业大学，
类型：发明
国别省市：DE[德国]