瑞替加滨在KCNQ5上的新的结合位点制造技术

在此公开的是突变的ＫＣＮＱ５钾通道的核酸和多肽序列，其缺少对于钾通道活化剂瑞替加滨的反应性。在此还公开的是与前述突变的ＫＣＮＱ５钾通道的用途相关的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
在此公开的是瑞替加滨在KCNQ5上的新的结合位点，以及基因、 核酸、蛋白质、载体和使用它们的方法。
技术介绍
离子通道是调节离子流动进出细胞的细胞蛋白质，所述离子包括 4丐、钾、钠和氯。这些通道影响这些过程，如神经传导、肌肉收缩和细 胞分泌。在离子通道之中，钾通道是最普遍和多样化的，在各种动物细 胞，例如神经、肌肉、腺体、免疫、生殖和上皮组织中发现。这些通道 容许在一定条件下钾流入和/或流出细月包。例如，在这些通道开方丈时钾离 子的流出使得细胞的内部更为负电性，对抗了施加到细胞的去极化电 压。这些通道由例如钙敏感性、电压门、第二信使、细胞外配体和ATP 敏感性调节。钾通道是一般作用于超极化神经元和肌细胞的跨膜蛋白质。生理学 研究表明，钾电流存在于大多数细胞中，并且与广泛的功能相关，包括 可兴奋细胞的电性质的调节。取决于钾通道的类型，它的功能可以受到 跨膜电压、不同的配体、蛋白质磷酸化或其他第二信使的控制(参见，例 如，美国专利No.6,893,858)。钾通道家族在哺乳动物组织中具有大约七十个成员。近来鉴定的 KCNQ亚族(Kv7)已经显示了作为细胞应激性的决定因素起到重要的功 能作用。新近的证据表明，KCNQ钾通道亚单位形成了几种组织类型中 M-电流活性的分子基础。这个基因家族已经进化到含有至少五个主要亚 单位，称为KCNQ1到KCNQ5(Kv7.1-7.5)。这些亚单位已经被证明共同 组装来形成异聚和同聚的功能性离子通道。电压依赖性钾通道是静止膜电位的关键调节物，调节电学活性细胞 例如神经元或肌细胞的应激性(excitability)。已经克隆了几种类型的电压 依赖性钾(K+)通道(参见，例如Lerche C et al., J. Biol. Chem. 275:22395-22400(2000))。五种KCNQ钾通道基因的四种中的突变与各种疾病相关联，引起心脏的LQT综合症(KCNQ1)、癫痫症(KCNQ2和3)、先天性耳聋(KCNQ4)。 由于KCNQ5在中枢神经系统(CNS)中展现的M-电流形成中的重要性， 认为的是，这个基因的失效将引起神经元应激性的失调(参见，例如 Lerche C et al., J. Biol. Chem. 275:22395-22400(2000); Schroeder BC et al. J. Biol. Chem. 275:24089-95(2000))。钾通道涉及多种生理学过程，包括心跳的调节、动脉的扩张、胰岛 素的释放、神经细胞的应激性、以及肾脏电解质转运的调节。瑞替加滨(^^&1^1^)(1^(2-氨基-4-(4-氟苯基氨基)-苯基)氨基曱酸乙 酯)已经发现打开某些类型的KCNQ通道，包括KCNQ5。然而，瑞替加 滨没有增强对KCNQ1的影响，KCNQ1与KCNQ5有37%的序列同 一性。 瑞替加滨通过提高这些通道的开放概率发挥它们的细胞影响(Main J, Mol. Pharmacol. 58:253-62(2000); Wickenden A et al., Mol. Pharmacol. 58:591-600(2000))。在单独的KCNQ通道的开放方面的这种增加总体地 引起细胞膜的超极化，特别是在去极化的细胞中，通过完整细胞KCNQ 介导的导电性的显著提高来产生。在此公开的是KCNQ5的突变体，其丧失了响应瑞替加滨的功能性质。专利技术概述一个方面是编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的分离的多核苷酸。另一个方面是包含选自以下构成的组的多核苷酸的分离的多核苷酸(a) 包含SEQIDNO: l的核酸序列；(b) 编码SEQ ID NO: 2的多核苦酸；(c) 编码多肽的与SEQ ID NO: 1具有至少约95%同源性的核酸序列， 条件是在核苷酸808-810的替换是针对产生对氨基酸亮氨酸的保守性替 换的密码子；(d) 能够在高度严格条件下与SEQ ID NO: 1杂交的核酸分子；(e) 与(a)、 (b)、 (c)或(d)互补的核酸分子；和(f) SEQIDNO: 1的变体。另一个实施方式是编码KCNQ5多肽的分离的多核苷酸，所述KCNQ5多肽含有来自KCNQ1的S5-S6 ^争膜结构域.进一步的方面是包含选自以下构成的组的多核苷酸的分离的多核 苷酸(a) 包含SEQ ID NO: 3的核酸序列，其中核苷酸769-1062被SEQ ID NO: 5替换；(b) 编码SEQ ID NO: 4的多核苷酸，其中氨基酸257-354被来自 KCNQ1的S5-S6跨膜结构域替换；(c) 能够在高度严格条件下与(a)或(b)的核酸序列杂交的核酸分子；和(d) 与(a)、 (b)或(c)互补的核酸分子。另 一个方面是包含选自以下构成的组的多核苷酸的分离的多核苦酸(a) 包含SEQIDNO: 3的核酸序列，其中核苷酸769-873被SEQ ID NO: 5的核苷酸1-105替换；(b) 编码SEQIDNO: 4的多核苷酸，其中SEQ ID NO: 4的氨基酸 257-291被来自KCNQ1的S5跨膜结构域替换；(c) 能够在高度严格条件下与(a)或(b)的核酸序列杂交的核酸分子；和(d) 与(a)、 (b)或(c)互补的核酸分子。另一个实施方式是包含选自以下构成的组的氨基酸序列的分离的 多肽(a) KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列；(b) 包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列； (cXa)的变体；和(d)与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少90%的同一性的氨基酸 序列，条件是在氨基酸270处的替换是氨基酸亮氨酸的保守性替换。进一步的方面是包含至少一个KCNQ5亚单位的KCNQ二聚通道， 所述KCNQ5亚单位是前述的分离的多肽。另一个方面是包含至少一个 KCNQ5亚单位的KCNQ四聚通道，所述KCNQ5亚单位是前述的分离 的多肽。进 一 步的实施方式是特异性结合包含SEQ ID NO : 2的 KCNQ5(W270L)多肽的抗体。另 一个方面是特异性结合包含来自SEQ ID NO: 2的至少8个连续 氨基酸的KCNQ5(W270L)多肽片段的抗体，其中所述片段包括SEQ ID NO: 2的氨基酸270。进一步的方面是含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的分离的 KCNQ5多肽。进一步的方面是含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的分离的 KCNQ5多肽。进一步的方面是包含至少一个KCNQ5亚单位的KCNQ 二聚通道，所述KCNQ5亚单位是含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构 域或S5跨膜结构域的前述的分离的KCNQ5多肽。另一个方面是包含至 少一个KCNQ5亚单位的KCNQ四聚通道，所述KCNQ5亚单位是含有 来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域或S5跨膜结构域的前述的分离的 KCNQ5多肽。另一个方面是筛选试剂的方法，所述方法包括(a) 用选自以下构成的组的KCNQ5分子接触试剂(i) 编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；(ii) 编码含有来自KCNQ1的S、SG跨膜结构域的KCNQ5多肽 的多核苷酸；(iii) 编码含有来自KCNQ1的S5 if争膜结构域的KCNQ5多肽的 多核苦酸；(iv本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码全部或部分ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）多肽的分离的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K刘，Q王，TM阿尔吉蒂里，
申请(专利权)人：惠氏公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]