本发明专利技术涉及一种小分子干扰ＲＮＡ在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途，这种小分子干扰ＲＮＡ可以沉没ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因表达，高效的调控肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞的周期，显著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞的细胞分裂。这种小分子干扰ＲＮＡ可以制备抑制肿瘤细胞分裂的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一个生存素survivin基因为靶标的小分子干扰RNA(siRNA)在制备调控肿瘤细胞周期药物中的用途。
技术介绍
RNA干扰技术(RNAi)是近几年发展起来的被认为是研究功能基因组最有力工具之一。这种新兴的生物技术为肿瘤分子水平的基因治疗提供了新的技术和方法。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)dsRNA)介导的转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象。通过在多种生物细胞内导入外源或内源的dsRNA可以使内源性mRNA发生特异性降解，从而引起相应基因转录的阻抑。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要杀手之一，目前还没有找到真正有效的根治方法，这迫使科研工作者不断寻找新的技术和方法，试图从根本上攻克癌症。 Survivin是1997年耶鲁大学Aitieric.DC等人在人类基因组库中首先筛选分离出来的IAP(凋亡抑制蛋白)家族的一个成员。它定位于17q25，该基因几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性地表达，而正常组织几乎没有表达；该基因在肿瘤细胞中高表达后，不但促进肿瘤细胞抗凋亡、促进肿瘤细胞有丝分裂、参与血管形成和放化疗耐受多种功能，而引起了国内外学者的广泛关注。 有研究者(.Lab Invest，1999，79(11)1327-1333；Am J Pathol，1998，152(1)43-49)对正常增殖细胞中survivin基因的潜在分布进行研究发现包括皮肤表面的角化细胞、肠道的上皮细胞和正常的骨髓细胞在内，在各种有丝分裂细胞系中均没有检测到survivin基因的表达；survivin具有在肿瘤组织中表达特异性强、表达率高，而在正常组织中不表达的特点以及在肿瘤的发生、发展及抗药性等诸多方面所扮演的重要角色而使它很有可能成为肿瘤基因治疗理想的新靶点。 肿瘤的难治还在于肿瘤的天然耐药以及后期治疗时产生的耐受。肿瘤本身高表达survivin能保护化疗药和放射线对肿瘤的杀伤相反，不足量的化疗药或放射线也能诱导survivin的表达，产生对治疗的继发耐受。研究表明，survivin能抑制某些化疗药物、IL-3，TNF-a，X射线诱导的Fas，Caspase，Bax等参与的凋亡信号通路(Cancer Res，1998，58(23)5315-5320；J CancerRes，2000，91(11)1204-1209)。但假如其唯一的BIR区发生C84A的突变，survivin也就丧失对抗化疗药物Taxol诱导的凋亡的抵抗作用。 血管形成过程取决于血管内皮细胞生存和凋亡的平衡。正常情况下，血管内皮细胞中很难检测到survivin。在血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的刺激下，静止的血管内皮表达survivin的能力约可增强4倍，VEGF的许多抗凋亡活性都是通过诱导内皮细胞表达survivin来实现的(Am J Pathol，2001，158(5)1757-1765)。血管生成素一1(angiopoietin-1，Ang-1)是胚胎血管形成过程中维持血管稳定性和管腔形成的关键因子。它没有促进内皮细胞生长，而只促进了血管网的稳定和分枝血管的形成。研究发现，Ang-1可以促进内皮细胞中survivin表达，通过Akt(或蛋白激酶B)途径激活survivin的抗凋亡活性，从而阻止内皮细胞凋亡，在体内血管形成过程中稳定血管结构(J Biol Chem，2000，275(3)9102-9105)。新血管生成是肿瘤生长和转移的必要因素，因此抑制survivin的表达可能对防止肿瘤细胞的浸润、迁移起重要作用。己有多项动物实验证明，反义survivin RNA或survivin突变体可以有效抑制实体瘤的血管形成和肿瘤的侵袭增殖。因此，survivin基因可以作为肿瘤治疗的新靶点。 最早的针对survivin的RNAi研究报导于2003年，Carvalho等用小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)转染HeLa细胞，60h后蛋白印迹结果显示治疗组中己检测不到survivin的表达，细胞增殖明显受抑，部分细胞有丝分裂受到阻滞，出现凋亡(J Cell Sci，2003，116(14)2987-2998)。随着RNAi技术的不断完善，由原来直接导入外源的siRNA，发展到真核表达载体转录产生siRNA，以及用于RNAi的病毒载体的出现，大大提高了转染效率和干扰效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核载体转染肝细胞癌SMMC7721细胞，发现转染细胞中几乎没有survivin基因的表达，转染细胞自发的凋亡增加，G2/M期细胞比例减少，细胞增殖减慢(World J Gastroenterol 2005，11(5)756-759)。目前针对survivin的RNAi研究进展迅速，体外实验显示了良好的效果，相信不远的将来会有更为丰富和完善的研究结果出现。 应用RNA干扰技术，以小分子RNA作为靶向药物，有针对性地对survivin基因的转录后表达进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，多层次，多途径对肿瘤进行抑制，这可能成为了一种新的肿瘤治疗策略。而且survivin基因选择性地表达在几乎所有种类的肿瘤组织中，而正常组织几乎不表达，则可使这种基因治疗对正常组织和细胞的毒副作用降到最低，应用RNAi特异地抑制survivin等肿瘤相关基因的表达有望成为一种新的肿瘤基因治疗方式。
技术实现思路
本专利技术公开了一种高效的针对survivin基因的广谱的小分子干扰RNA(siRNA)调控肿瘤细胞分裂周期药物，由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成 正义链5′-AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt-3′， 反义链3′-ttUUUCGUAAGCAGGCCAACG-5′ 其中X代表tt、TT或UU。t代表脱氧胸腺嘧啶dT。 X优选代表tt。 本专利技术的小分子干扰RNA是主要针对survivin基因开放阅读框(ORF)的功能保守区设计的双链siRNA，药理试验证明本专利技术的小分子干扰RNA具有广谱的抗肿瘤作用，对肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞在体外均有抑制作用，该序列的正义链与survivin基因的mRNA结合，干扰survivin基因mRNA的翻译，从而抑制肿瘤细胞分裂，使肿瘤细胞分裂阻滞在G2/M期，达到治疗肿瘤的目的。本专利技术是一种全新作用机制的抗肿瘤新型药物，可能为肿瘤的治疗带来了新的希望。 本专利技术所述的肿瘤疾病包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞。 在临床使用中，可以将本专利技术小分子干扰RNA(简称CPUsiRNA4)溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，建议CPUsiRNA4为10微克/微升。取适量CPUsiRNA4与小分子干扰RNA转染试剂R本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双链小分子干扰ＲＮＡ，其特征是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成： 正义链 ５′－ＡＡＡＧＣＡＵＵＣＧＵＣＣＧＧＵＵＧＣｔｔ－３′， 反义链 ３′－ｔｔＵＵＵＣＧＵＡＡＧＣＡＧＧＣＣＡＡＣＧ－５′ 其中Ｘ代表 ｔｔ、ＴＴ或ＵＵ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆云华，
申请(专利权)人：宜春学院，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]
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