本发明专利技术的目的是提供特抑制人类细胞周期蛋白Ａ↓［２］的ｓｉＲＮＡ及其应用。所述的ｓｉＲＮＡ对应的靶序列是人类细胞周期蛋白Ａ↓［２］的ｍＲＮＡ，所述的ｓｉＲＮＡ长度为１６－３０ｂｐ，含有如下所示的核酸序列：５’－ＣＣＡ ＵＵＧ ＧＵＣ ＣＣＵ ＣＵＵ ＧＡＵ ＵＴＴ－３’；５’－ＡＡＵ ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＵＧ ＧＴＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。所述的ｓｉＲＮＡ的３’端含有２－４个ｄＴ或２－６个Ｕ的延伸结构。所述的ｓｉＲＮＡ以己二胺功能化的碳纳米管为载体，经转染使Ｋ５６２细胞的人类细胞周期蛋白Ａ↓［２］的ｍＲＮＡ表达水平下降６０－９５％。其作为活性成分用于制备抑制细胞增值、促进细胞凋亡的抗肿瘤药物，其含量为０．００１－９９．９９９％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和生物医学领域。本专利技术涉及特异性抑制人类细胞周 期蛋白A2 (cyclin A2)的siRNA及其应用。RNA千扰(RNAinterfering, RNAi)是由与靶基因序列同源的双链RNA引 发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。RNAi首先由 Andrew Fire等于1998年首先在秀丽线虫中发现，随后被广泛发现于真菌、拟南 芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。ElbashirSM等于2001年 利用人工合成小分子双链RNA在哺乳细胞中发挥RNAi作用，自此以后，RNAi 成为分子医学强有力的工具。人类细胞周期蛋白A2是细胞周期蛋白家族的一员，参与Gl/S期和G2/M期 转换，在DNA复制、转录过程中发挥重要的作用。过高的人类细胞周期蛋白 八2表达水平导致S其缺陷和染色体的不稳定，其表达水平失常参与肿瘤转tt;和 肿瘤发生的过程。在星形细胞瘤、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胃癌、白血病、 肝癌、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌等都发现人类细胞周期蛋 白A2过量表达，且其高表达水平是肝癌、非小细胞肺癌、头颈癌、胃癌、白血 病等的不良预后的标志。因此下调或抑制人类细胞周期蛋白A2是肿瘤治疗的一 种有效手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供异性抑制人类细胞周期蛋白A2的siRNA及其应用。本专利技术的第一方面中，提供特异性抑制人类细胞周期蛋白八2的siRNA，所述的siRNA对应的耙序列是人类细胞周期蛋白A2的mRNA,所述的siRNA长度 为16—30bp，含有如下所示的核酸序列.-5，- CCAUUG GUC CCU CUU GAU UTT- 3，5'-AAUCAAGAGGGACCAAUGGTT誦3，(SEQIDNO: 1);较佳地，所述的siRNA的3，端含有2—4个dT或2—6个U的延伸结构；所述的siRNA以己二胺功能化的碳纳米管为载体，经转染使K562细胞的人 类细胞周期蛋白A2的mRNA表达水平下降60_95 % 。本专利技术的第二方面涉及所述的siRNA的应用，所述的siRNA用于制备抑制 细胞增殖、促进细胞凋亡的治疗肿瘤的药物。所述的siRNA作为该药物的活性 成分，其质量含量为0.001—99.999%。 '如附图所示，将如上所述的siRNA转入K562细胞，用RT-PCR和免疫印迹 检测其对人类细胞周期蛋白A2表达的抑制，用苔酚蓝拒染法计数和软琼脂克隆 形成实验检测其对细胞增值的影响，用流式细胞仪检测亚二倍体峰 (subGl peak)和DNAladder gel电泳检测凋亡DNA片段来观察其对细胞凋亡的影响。 结果表明RT-PCR和免疫印迹实验显示如上所述的siRNA能特异性抑制人类细 胞周期蛋白A2的表达,抑制效率在70X以上;苔酚蓝计数显示如上所述的siRNA 能显著抑制细胞生长；软琼脂克隆形成实验显示如上所述的siRNA能显著抑制 细胞增值；流式细胞检测亚二倍体峰实验和DNA ladder gel电泳实验显示上所述 的siRNA能促进细胞凋亡。附图说明图1: RT-PCR检测本专利技术所述siRNA对人类细胞周期蛋白A2 mRNA表达水平的影响图。图2:免疫印迹检测本专利技术所述siRNA对人类细胞周期蛋白A2蛋白表达.水 平的影响图。图3:苔酚蓝拒染细胞计数检测本专利技术所述siRNA对肿瘤细胞生长的影响图。 图4:软琼脂克隆形成实验检测本专利技术所述siRNA对肿瘤细胞增殖的影响图。 图5:流式细胞仪检测本专利技术所述siRNA对肿瘤细胞凋亡的影响图。 图6: DNAladder gel电泳检测本专利技术所述siRNA对细胞凋亡的影响图。具体实施方式实施例1: siRNA的合成本专利技术施例中的针对人类细胞周期蛋白A2的siRNA是根据Elbashir user guider原则设计，针对人类细胞周期蛋白A2 mRNA的524—544位点选取的一 段21bp的siRNA，其序列如下所示si國CA5，- CCAUUG GUC CCU CUU GAU UTT誦3'5'隱AAUCAAGAGGGACCAAUGGTT國3，(SEQIDNO: 1)Si-CA作用的耙位点如下所示5，-AAC CAT TGG TCC CTC TTG ATT- 3， (524 — 544位)(SEQ ID NO: 2)阴性对照siRNA (SEQIDNO: 3)为与人、小鼠、大鼠基因均无任何同源性 的杂乱序列，其序列下所示5 ，- UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT- 3'5，- ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT- 3，( SEQ ID NO: 3)siRNA的体外化学合成由上海吉玛制药技术有限公司完成。 实施例2:转染转染主要有如下步骤(1) 待转染细胞的准备将K562细胞接种于含10X胎牛血清、2mmol/L谷 胺酰胺的IMDM(IscoVe's modified Dulbecco's medium)培养基中，置于37。C， 5 %C02 (v/v)浓度的饱和湿度培养箱中，于实验前两周无药培养。(2) siRNA:碳纳米管复合物的制备(a) 己二胺功能化的碳纳米管是根据相关专利制备的(参考文献中国专利 申请号200610016734.4)。(b) 将siRNA与己二胺功能化的碳纳米管按照1:100 (w/w)的比例混匀，室 温15—30。C下放置一个小时。G)转染将细胞接种于6孔或24孔培养板中，密度为0.5 — 1.2><105细胞 /mL，将siRNA:碳纳米管复合物加入细胞中，siRNA终浓度为40 n mol/L，然后 置于37"C， 5%C02 (v/v)浓度的饱和湿度培养箱中培养。 ' 实施例3: RT-PCR检测转染细胞人类细胞周期蛋白A2mRNA表达水平方法如下细胞中总RNA的提取制备按照Trizol试剂(Invi加gen公司)的说明进行。 细胞离心后，加入lmL的Trizol试剂，充分匀浆；加入0.2mL氯仿混匀，室温 放置5分钟，4°C， 12， 000Xg离心10分钟；取上层水相置于新管，加入0.5mL 异丙醇，一2(TC放置30分钟后，4°C， 12， 000Xg离心15分钟；弃上清，用 75%的乙醇洗涤沉淀，4°C， 12， OOOXg离心10分钟，弃上清;小心吸取残留乙 醇，室温下放置15分钟干燥；溶解于40 uL的TE溶液(10 m mol/Tris-HCl,lm mol/L EDTA, pH 7.0);跑甲醛琼脂糖凝胶电泳观察28S和18SrRNA条带是否清晰，以确保所提取的RNA的完整性，测紫外光谱对提取的RNA进 行纯度的鉴定和浓度的确定。RT-PCR扩增及鉴定将提取的总RNA用RNase-free DNase ((l U&L Takara; Dalian, China),在37。C下温育30分钟，然后在75。C处理5分钟以灭活DNase。 取0.5吗细胞总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0的说明进行PCR扩增。人类细胞周期蛋白A2的上游引物序列如下所示 '5，- TCC ATG TCA GTG CTG AGA GGA -3'本文档来自技高网...
【技术保护点】
抑制人类细胞周期蛋白Ａ↓［２］表达的ｓｉＲＮＡ，其特征在于，所述的ｓｉＲＮＡ对应的靶序列是人类细胞周期蛋白Ａ↓［２］的ｍＲＮＡ，所述的ｓｉＲＮＡ长度为１６－３０ｂｐ，含有如下所示的核酸序列： ５’－ＣＣＡ ＵＵＧ ＧＵＣ ＣＣＵ ＣＵＵ ＧＡＵ ＵＴＴ－３’ ５’－ＡＡＵ ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＵＧ ＧＴＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曲晓刚，王晓辉，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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