一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法技术

本发明专利技术提供一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法，包括：1)分别对各稀释度的代表污染细菌稀释菌悬液进行NB平板培养计数和荧光染色测定，代表污染细菌为食用菌液体菌种常见污染细菌菌株；根据各稀释度菌悬液平板计数结果(Bq)及相应荧光染色测定结果(Fg)建立标准曲线；2)使用适合滤除食用菌菌丝的滤膜，过滤食用菌液体菌种培养液；随后，离心滤液，弃去培养液，并利用无菌生理盐水洗涤菌体沉淀物，再沉淀后，取无菌水对沉淀细菌细胞再悬浮，并进行梯度稀释；3)对步骤2)中获得的污染细菌系列梯度菌悬液进行染色并测定荧光值，并依据标准曲线计算食用菌液体菌种中污染细菌浓度。该方法可快速、精确测定食用菌液体菌种污染细菌数量。

Method for detecting bacterial contamination of edible fungus liquid strain

The invention provides a kind of edible mushroom liquid bacterial contamination detection method, including: 1) respectively on various dilutions of representative bacterial dilution bacterial suspensions were determined by NB plate culture counting and fluorescence, representing the bacterial contamination for edible fungi pollution bacteria strains; according to the dilution of the bacterial suspension plate count results (Bq) and the corresponding fluorescence staining results (Fg) to establish the standard curve; 2) using the membrane filter for edible fungi, edible fungus cultivation liquid filtration; subsequently, centrifugal filtrate, discard the culture medium, and the use of sterile saline wash was precipitate, and then precipitated after taking the sterile water to precipitation bacterial cells were resuspended and gradient dilution; 3) to step 2) contaminated bacteria in the series of gradient suspension staining and fluorescence determination value, and on the basis of standard curve calculation of food Concentrations of contaminating bacteria in liquid bacteria. This method can be used to determine the quantity of bacteria in edible fungi and liquid contamination rapidly and accurately.

【技术实现步骤摘要】
一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法
本专利技术涉及一种液体菌种质量检测的方法，尤其涉及一种食用菌工厂化栽培过程中液体菌种的质量检测方法，属于微生物领域。
技术介绍
我国食用菌工厂化产业经历了20多年的发展历程，栽培设施硬件和技术水平均有了巨大的进步与创新。菌种制备作为食用菌工厂化栽培过程的重要环节，逐渐由传统的基于固体培养基料的二级、三级种生产工艺发展为具有纯度高、活力强、周期短、成本低等优点的液体菌种生产工艺。液体菌种的应用大大缩短食用菌栽培周期，为食用菌工厂化高效标准化生产奠定了重要基础，但液体菌种生产过程极易产生细菌污染，并且传统固体菌种质量检查方法很难用来对液体菌种进行质控。目前文献报道的有关食用菌液体菌种细菌污染的检测方法，主要包括感观判断、显微镜观察、酸碱度测定以及培养检测等。通过颜色、气味以及形态等指标的感观判断，虽然对于菌种发酵早期污染有较高准确度，但对始于发酵后期的污染易造成失误，同时并非所有细菌污染均会形成明显的感官特征，并且主观性的感官判断缺乏统一标准；显微镜观察以及基于酸碱度变化的测定对液体菌种中的少量细菌污染检测精度不够，因此这些方法均可能形成误判，从而可能造成生产上的严重损失。与上述检测方法相比，培养方法可较为准确地判断液体菌种污染状况，但由于培养时间一般需要24小时至48小时，检测时效性较差，可能延误液体菌种最佳接种时间，降低液体菌种发酵设备的利用效率。因此建立快速、精确的细菌污染检测技术，是液体菌种技术安全、高效应用的关键。有关食用菌液体菌种质量检测的专利技术申请只有1件(CN105087750A，“食用菌液体菌种检测器”)，是一种用于液体菌种浓度检测的装置。针对液体菌种细菌污染检测的专利申请信息几乎未见。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、精确测定食用菌液体菌种污染细菌数量的检测方法。其基本理念是：运用BAClight染色法对经过了特异性分离的食用菌液体菌种中的污染细菌进行荧光染色，通过建立细菌浓度与荧光定量指标的数学关系模型，快速、精确测定食用菌液体菌种污染细菌数量。为了实现以上目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法，包括如下步骤：1)标准曲线制备：分别对获得的各稀释度的代表污染细菌稀释菌悬液进行NB平板培养计数和荧光染色测定，所述的代表污染细菌为食用菌液体菌种常见污染细菌污染细菌G-和G+类污染细菌中分别至少一种，如：假单胞菌(G-)和枯草芽孢杆菌(G+)；随后根据各稀释度菌悬液平板计数结果(Bq)及相应荧光染色测定结果(Fg)建立标准曲线，以明确每种代表污染细菌数量与荧光值之间线性关系范围。进一步地，所述的代表污染细菌可以是两种或者多种代表污染细菌株；优选地，所述的标准曲线可以是所使用的代表污染细菌株标准曲线的拟合标准曲线。2)根据食用菌菌丝与细菌细胞个体大小及形态的差异性，采用孔径适宜的滤膜，即：适合过滤食用菌菌丝的滤膜，如：孔径5μm尼龙网，对液体菌种进行过滤，将食用菌丝球从液体菌种培养液滤除，避免其对污染细菌定量检测产生干扰，优选地，重复过滤3次；随后，对滤液进行离心，弃去培养液，并利用无菌生理盐水对菌体沉淀物进行洗涤，再沉淀，取无菌水对沉淀细菌细胞进行再悬浮处理，并进行梯度稀释形成系列梯度菌悬液。3)对步骤2)中获得的污染细菌系列梯度菌悬液进行染色并测定荧光值，方法同步骤1)中的标准曲线制备，并依据标准曲线计算食用菌液体菌种中污染细菌浓度。4)校正系数和校正公式的计算：通过待测菌种定量加入典型污染菌，形成模拟细菌污染液体菌种，并采用步骤2)及3)检测计算其污染细菌浓度(测量值)，并与液体菌种中实际掺入污染细菌浓度比对，获得校正系数；其校正公式为：实际值＝测量值×校正系数。其中，校正系数是考虑抽滤过程污染细菌菌体有一部分仍粘附于食用菌菌丝球中，从而使得通过上述方法获得的污染细菌浓度低于实际浓度，因此建立了一个校正公式。通过上述技术方案，本专利技术达到了如下的有益效果：本专利技术提供的液体菌种细菌污染检测方法可以把检测时间控制在90分钟内，测定结果与基于培养的检测结果误差小；相对于现有技术中的感官判断及镜检检测方法具有明显的准确度优势，并且相对于传统培养检测法具有便捷快速优势，因此是一种快捷、准确的食用菌液体菌种细菌污染检测方法；本专利技术方法针对液体菌种中污染细菌活细胞进行精确的定量测定，从而为食用菌液体菌种工厂化应用提供了快速、准确、便捷的检测手段，具有较广泛的应用推广价值。附图说明图1是本专利技术食用菌液体菌种污染细菌数量荧光染色定量测定标准曲线建立流程图。图2是本专利技术一种食用菌液体菌种中污染细菌分离与检测流程图。图3是本专利技术模拟细菌污染的食用菌液体菌种中细菌数量测定及校正系数确定流程图。图4是本专利技术中两种典型污染细菌的荧光染色强度与平板计数结果的关系曲线(标准曲线)。图中分别列出了荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌活菌浓度与BAClight染色绿荧光强度之间的数学关系以及两者拟合后的活菌数量与绿荧光强度之间的数学关系。图5是抽滤装置示意图。其中，无菌环境指超净工作台环境，确保空气中杂菌对抽滤过程产生污染。图中，1.滤杯，2.夹子，3.滤头，4.锥形瓶，5.真空泵。具体实施方式为了阐明本专利技术的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本专利技术做进一步的介绍。实施例1：实施例1是本专利技术所提供的食用菌液体菌种细菌污染检测方法的一种具体实施方式，包括以下步骤：1.标准曲线制备图1是本专利技术食用菌液体菌种污染细菌数量荧光染色定量测定标准曲线建立流程，分别采用平板计数与荧光染色两种方法获得细菌浓度数值，并构建两者数学关系，形成标准曲线。本专利技术是以两种典型污染细菌假单胞菌及枯草芽孢杆菌纯菌株作为样本的，本流程同样适用于具体食用菌液体菌种生产过程中其它常见污染细菌荧光定量测定标准曲线的构建。其具体操作步骤如下：1.1以常见食用菌液体菌种污染细菌假单胞菌(G-)及枯草芽孢杆菌(G+)作为污染细菌代表菌株，分别接种于灭菌NB液体培养基中摇瓶培养，培养条件：28℃恒温，摇床转速:180r/min，培养24小时后培养液细菌浓度(OD600)范围约为1.8-2.0；1.2分别取假单胞菌、芽孢杆菌培养液10ml至50ml无菌离心管中，10000r/min离心5min，弃上清；1.3用灭菌生理盐水30ml充分洗涤菌体沉淀3次，每次均10000r/min离心5min，弃上清；1.4取10ml无菌水对沉淀细菌细胞进行再悬浮处理，利用涡旋仪使细菌沉淀在液体中分散均匀，并进行10倍梯度稀释形成系列梯度菌悬液；分别取200μl各梯度稀释菌液涂布于灭菌NB平板培养基，28℃恒温培养24小时后计数，计算各梯度稀释液中活菌浓度(Bq)；1.5分别对上述制备的假单胞菌、枯草芽孢杆菌梯度稀释菌悬液(稀释倍数为100～10-10)进行荧光染色，染色剂分别用2.5mL灭菌去离子水溶解，实验时等比例混合，具体方法：于1ml系列稀释菌悬液分别加入25μlSYTO9+PI(1:1混合)，均匀混合，室温避光染色15min；1.6利用上海棱光F97Xp荧光分光光度计测定上述各稀释度细菌染液荧光强度，仪器测定条件：激发波长470nm，发射波长510nm，激发、发射光谱带宽均为5nm，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)标准曲线制备：分别对获得的各稀释度的代表污染细菌稀释菌悬液进行NB平板培养计数和荧光染色测定，所述的代表污染细菌为食用菌液体菌种G

【技术特征摘要】
1.一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)标准曲线制备：分别对获得的各稀释度的代表污染细菌稀释菌悬液进行NB平板培养计数和荧光染色测定，所述的代表污染细菌为食用菌液体菌种G-和G+类污染细菌中分别至少一种；随后根据各稀释度菌悬液平板计数结果(Bq)及相应荧光染色测定结果(Fg)建立标准曲线；2)使用适合滤除食用菌菌丝的滤膜，过滤液体菌种培养液；随后，离心滤液，弃去培养液，并利用无菌生理盐水洗涤菌体沉淀物，再沉淀后，取无菌水对沉淀细菌细胞进行再悬浮处理，并进行梯度稀释形成系列梯度菌悬液；3)对步骤2)中获得的污染细菌系列梯度菌悬液进行染色并测定荧光值，并依据标准曲线计算食用菌液体菌种中污染细菌浓度。4)校正系数和校正公式的计算：通过待测菌种定量加入步骤1)所使用的典型污染菌，形成模拟细菌污染液体菌种，并采用步骤2)及3)检测计算其污染细菌浓度(测量值)，并与液体菌种...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡建，梅丽娟，张洋，李青，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32