用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法技术

本发明专利技术公开了一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测，包括以下步骤：1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；2)对数据进行首次分类，3)根据首次分类的结果得出阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布；4)计算最终判决阈值t；5)利用所述判决阈值t对数据进行二次分类；6)计算样品浓度。本发明专利技术的方法对数字PCR荧光微滴荧光强度分布进行了准确描述，能够在无需阴性对照的情况下自动确定合适的阈值从而识别阳性微滴的数量，能有效提高数据分类的准确率，从而能显著提高荧光液滴检测结果的精确性。

Fluorescence intensity data processing method for fluorescent liquid drop detection

The invention discloses a method for processing the fluorescence intensity data of fluorescence detection of droplets in the liquid droplet, for nucleic acid fluorescence based detection, which comprises the following steps: 1) to obtain all fluorescence droplet fluorescence intensity data, and pretreatment; 2) for classification of data, 3) according to the classification for the first time the results show that the negative and positive droplet droplet fluorescence intensity distribution; 4) to calculate the final decision threshold of T; 5) using the decision threshold T two classification data; 6) to calculate the sample concentration. The method of the invention of the digital PCR fluorescence droplet fluorescence intensity distribution were described accurately, can automatically determine the number of the appropriate threshold to identify positive droplets without negative control conditions, can effectively improve the accuracy of data classification accuracy, which can significantly improve the fluorescence drop test results.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法
，尤其是一种基于荧光液滴的核酸检测的阳性液滴自动识别方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究。数字PCR是近年来发展迅速的新一代定量PCR分析技术，利用微流控技术将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有至少一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统的荧光定量PCR相比，具有高灵敏度、高特异性、无需标准定量曲线等优点。数字PCR技术提出至今，相关技术和产业化发展都非常迅速，迄今为止，数字PCR技术主要有三类:微反应室孔板、大规模集成微流控芯片和液滴数字PCR系统。早期的数字PCR采用96/384孔板作为反应单元，随着对测试灵敏度和准确度的要求不断提高，反应单元的数目不断增加，使得操作的复杂度和所需试剂量也成倍增加。大规模集成微流控芯片技术的出现为数字PCR分析提供了一个低成本、小体积和高通量平行分析的方案。液滴式数字PCR系统源于乳液PCR技术，通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的PCR反应体系，比微孔板和集成微流控芯片系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成本低，因此成为理想的数字PCR技术平台。液滴微流控芯片是近年来在微流控芯片基础上发展起来的一种新的操纵微量液体的技术。与传统微通道芯片相比，微液滴的体积更小(10-9L-10-12L)，可灵活操控，尺寸均一，形状可变，传热传质性能优秀，并具有高通量分析的良好潜力。将液滴微流控技术应用在生化分析领域，常使用荧光标记感兴趣的细胞或分子，通过识别带荧光液滴检测样品中待测物浓度。因此准确地确定荧光阈值对最终结果具有重要影响，目前基于荧光微滴PCR核酸检测的阈值确定方法有两种，一种是使用无待测样品的阴性质控品，通过统计该质控品中微滴的最大荧光强度决定判别阈值，这种判决方法的识别准确性高，但需要参考阴性质控；另一种则基于Kmeans聚类算法，该方法无需对比，但由于荧光微滴的分布并非简单两类，而存在多种干扰，最终结果往往出现较大偏差。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测中液滴的自动识别，尤其可用于液滴式样品的荧光检测中的荧光液滴的自动识别，包括以下步骤：一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其用于基于荧光液滴的核酸检测，其特征在于，包括以下步骤：1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；2)对所述步骤1)中的数据进行首次分类，得到阳性液滴和阴性液滴的首次分类范围，所述首次分类的方法包括传统聚类算法或基于模型的聚类算法；3)根据所述步骤2)的首次分类结果得出阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布，再利用极大似然估计方法分别将阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布拟合为单参数正态分布，再根据各自的正态分布结果分别计算其统计特性值，包括峰值、均值和标准差；4)根据判决公式：t＝pn+α·σ计算最终判决阈值t，其中pn为阴性液滴强度峰值，α为调整因子，σ为阴性荧光强度分布的标准差；5)利用所述判决阈值t对所述步骤1)中的数据进行二次分类，识别阳性液滴与阴性液滴，并计算阳性液滴占总液滴的比例，再根据泊松公式：计算出平均每滴液滴中的待测物拷贝数，其中为平均每滴液滴中的待测物浓度，p表示液滴为阳性液滴的概率，其估计值为即为阳性液滴占总液滴的比例，H为阳性液滴数，C为液滴总数；是p的无偏估计；6)根据浓度计算公式：计算出样品中的待测物浓度，其中Con为样品中的待测物浓度(拷贝数/uL)，Vd为液滴体积。优选的是，所述步骤1)中获取所有荧光液滴的荧光强度的数据的方法包括：通过激发光依次照射激发所有样品液滴，使其产生荧光，再检测样品液滴产生的荧光强度的原始值，并收集激发光强度、样品液滴流速和样品液滴直径参数，再绘制时间-光强曲线并根据时间-光强曲线查找峰值，再利用所述收集的激发光强度、样品液滴流速和样品液滴直径参数校正测得的荧光强度的原始值，最终获得能用于所述步骤1)的所有荧光液滴的荧光强度的数据。优选的是，所述步骤5)中识别阳性液滴与阴性液滴的方法包括：通过权利要求2中所述的时间-荧光强度曲线查找峰值，再将每个液滴的峰值荧光强度与所述步骤4)中得到的判决阈值t进行对比，峰值高于判决阈值t的即为阳性液滴，反之，则为阴性液滴。优选的是，计算阳性占比的方法为：分别统计阳性液滴数与阴性液滴的个数，依次计为H和h，计算出阳性液滴占比优选的是，所述步骤1)中的预处理方法为使用简单移动平均法对数据直接进行平滑，以去除随机背景噪声。优选的是，所述步骤2)中的首次分类的方法包括Kmeans聚类算法。优选的是，所述步骤2)中的首次分类的方法还包括GMM模型聚类算法。优选的是，所述步骤4)中的调整因子α根据所述步骤3)中的统计特性值确定，调整因子α的值须使得99％以上的阴性液滴在判决阈值t以下。本专利技术的用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法用于基于荧光液滴的核酸检测，在先获取所有荧光液滴的荧光强度的数据后，利用本专利技术提供的方法对获取的所有荧光液滴的荧光强度的数据进行处理，以最终得到荧光液滴的检测结果。其中，所述步骤1)中获取所有荧光液滴的荧光强度的数据的装置可由专利号为201410682234.9、专利名称为“一种液滴式样品荧光检测系统和方法”的专利中提供，其先通过激发光检测模块调整光源强度至指定强度I；再将样品从储液池中吸入至充满样品通道，随后吸入载运液滴的分散相，并检测液路稳定后荧光探测模块接收到的光强平均值作为背景荧光，设其强度为F0；然后检测稀释后的样品液滴的荧光强度，在此过程中控制器模块通过激发光探测模块和荧光探测模块收集激发光强度、液滴流速和液滴直径-参数；再根据时间-荧光强度曲线查找峰值，并利用上述参数识别有效液滴并校正测得的荧光强度。其校正后的荧光强度即作为本专利技术所述的步骤1)中的荧光液滴的荧光强度的数据。通过本专利技术提供的用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，能确定更加精确用于荧光液滴分类的阈值，从而改善荧光液滴的识别精度，提高荧光检测结果的准确性。本专利技术的有益效果：本专利技术的方法对数字PCR荧光微滴荧光强度分布进行了准确描述，能够在无需阴性对照的情况下自动确定合适的阈值从而识别阳性液与阴性液滴的数量，能有效提高数据分类的准确率，从而能显著提高荧光液滴检测结果的精确性。本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。附图说明图1为本专利技术的用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法的原理算法示意图；图2为一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；2)对所述步骤1)中的数据进行首次分类，得到阳性液滴和阴性液滴的首次分类范围，所述首次分类的方法包括传统聚类算法或基于模型的聚类算法；3)根据所述步骤2)的首次分类结果得出阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布，再利用极大似然估计方法分别将阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布拟合为单参数正态分布，再根据各自的正态分布结果分别计算其统计特性值，包括峰值、均值和标准差；4)根据判决公式：t＝pn+α·σ计算最终判决阈值t，其中pn为阴性液滴强度峰值，α为调整因子，σ为阴性荧光强度分布的标准差；5)利用所述判决阈值t对所述步骤1)中的数据进行二次分类，识别阳性液滴与阴性液滴，并计算阳性液滴占总液滴的比例，再根据泊松公式：λ^=-ln(1-p^)=-ln(1-HC)]]>计算出平均每滴液滴中的待测物拷贝数，其中为平均每滴液滴中的待测物浓度，为阳性液滴占总液滴的比例，H为阳性液滴数，C为液滴总数；6)根据浓度计算公式：Con=λ^*1000Vd]]>计算出样品中的待测物浓度，其中Con为样品中的待测物浓度，Vd为液滴体积。...

【技术特征摘要】
1.一种用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获取所有荧光液滴的荧光强度的数据，并进行预处理；2)对所述步骤1)中的数据进行首次分类，得到阳性液滴和阴性液滴的首次分类范围，所述首次分类的方法包括传统聚类算法或基于模型的聚类算法；3)根据所述步骤2)的首次分类结果得出阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布，再利用极大似然估计方法分别将阴性液滴和阳性液滴荧光强度分布拟合为单参数正态分布，再根据各自的正态分布结果分别计算其统计特性值，包括峰值、均值和标准差；4)根据判决公式：t＝pn+α·σ计算最终判决阈值t，其中pn为阴性液滴强度峰值，α为调整因子，σ为阴性荧光强度分布的标准差；5)利用所述判决阈值t对所述步骤1)中的数据进行二次分类，识别阳性液滴与阴性液滴，并计算阳性液滴占总液滴的比例，再根据泊松公式：λ^=-ln(1-p^)=-ln(1-HC)]]>计算出平均每滴液滴中的待测物拷贝数，其中为平均每滴液滴中的待测物浓度，为阳性液滴占总液滴的比例，H为阳性液滴数，C为液滴总数；6)根据浓度计算公式：Con=λ^*1000Vd]]>计算出样品中的待测物浓度，其中Con为样品中的待测物浓度，Vd为液滴体积。2.如权利要求1所述的用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法，其特征在于，所述步骤1)中获取所有荧光液滴的荧光强度的数据的方法包括：通过激发光依次照射激发所有样品液滴，使其产生荧光，再检测样品液滴产生的荧光强度的原始值，并收集激发光强度、样品液滴流速和样品液滴直径参数，再绘制时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘聪，董文飞，黎海文，张涛，蒋克明，周武平，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32