一种蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法技术

本发明专利技术提供了一种利用疏水荧光探针ANS检测蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的方法，属于生物技术领域。该方法利用线性生物大分子底物与蛋白质结构域的相互作用，来封闭蛋白质结构域表面的疏水区域，从而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白质结构域表面疏水区结合，造成荧光强度降低。该方法可应用于蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的定性定量分析，为研究线性生物大分子与蛋白质结构域相互作用提供新的实验思路及技术手段。

Method for measuring interaction between protein domain and linear biological macromolecule

The invention provides a method for detecting the interaction between a protein domain and a linear biological macromolecule by using a hydrophobic fluorescent probe ANS, belonging to the field of biotechnology. The interaction of the method using linear macromolecular substrate and protein domains, to close the hydrophobic regions of the protein domains on the surface, thereby blocking the binding of hydrophobic fluorescent probe ANS and protein domain surface hydrophobic region, resulting in the fluorescence intensity decreased. This method can be applied to the qualitative and quantitative analysis of protein domains and linear interactions of biological macromolecules, provide experimental ideas and new techniques for the study of linear macromolecules and protein domain interaction.

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法
本专利技术涉及一种利用疏水荧光探针ANS检测蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的方法，属于生物

技术介绍
生物大分子是指自然界中存在于生物体内的大分子分子物质，一般以线性大分子状态存在，如胶原蛋白、弹性蛋白、淀粉、纤维素等。生物大分子及其衍生物是一类重要的生命物质，协助机体多种的生理生化功能的实现。生物大分子材料目前已广泛应用于生物医学、材料科学等领域，并应用于治疗、修复或替换生物体受损的组织或器官，增进或恢复其功能。为了使生物大分子更好的应用于生物材料，可以通过化学或是物理方法，采用复合、交联等手段处理大分子，虽然改善了材料的性能，但通过化学处理或交联后会出现力学强度降低、降解速度变快、免疫原性增强、毒性变大等一系列问题。为获得更理想的生物材料，必须开发新的制备方法或寻求新的具有特殊功能的功能蛋白或蛋白质结构域，来对生物大分子进行加工。目前已经发现很多蛋白质结构域具有定向吸附、膨胀生物大分子的功能，如PPC结构域、PKD结构域、CBD结构域等等。可利用它们的不同特性对生物大分子进行有针对性的改造。这些结构域具有的共同特点是表面具有疏水区域，且结构多为β片层结构。蛋白质结构域表面疏水性对决定其空间构象，保持自身稳定性以及行使生物学活性有着重要的作用。疏水区域可以帮助蛋白质结构域与其他生物分子之间实现相互作用。目前发现的许多可与线性生物大分子相互作用的蛋白质结构域多具有疏水特性。要想定性定量的分析不同蛋白质结构域与线性生物大分子材料之间的相互作用，就需要有高效和准确的检测方法。然而，目前研究蛋白质相互作用的常用实验方法主要有酵母双杂交系统、亲和层析、免疫共沉淀、Pull-down、双分子荧光互补、表面等离子共振分析等。这些方法要么步骤比较繁琐，结果不稳定，要么检测成本较高，适用范围较窄。因此，急需一种快速、高通量、灵敏稳定的检测方法，来测定蛋白质结构域与线性生物大分子之间的相互作用。8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐(Ammonium8-Anilino-1-naphthalenesulfonate,ANS)是一种常见的蛋白质疏水区域荧光探针。1965年，Stryer报道了ANS与脱辅基蛋白质及血晶素的疏水区域结合后荧光量子产率显著增大的现象，提出利用ANS作为荧光探针用于研究蛋白质的疏水区域。目前ANS已被广泛应用于蛋白质表面疏水性的检测。基于此，本专利技术提供一种新型检测蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的方法，利用线性生物大分子底物与蛋白质结构域的疏水相互作用，封闭其表面的疏水区域，进而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白质结构域表面疏水区结合，从而造成了荧光强度降低。该方法可有效应用于蛋白质结构域与线性大分子之间疏水相互作用的分析，为研究生物大分子物质与蛋白质相互作用提供新的实验思路及技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种更为快速、准确、简便的检测蛋白质结构域与线性生物大分子疏水相互作用的新方法。该方法利用线性生物大分子底物与蛋白质结构域的相互作用，来封闭蛋白质结构域表面的疏水区域，从而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白质结构域表面疏水区结合，造成荧光强度降低。该方法具有操作简单、快速、成本低廉、需要蛋白质用量少等优点，可应用于蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的定性定量分析。该方法大大的缩短了实验周期，可实现对多种蛋白质结构域与多种线性大分子底物疏水相互作用进行高通量快速检测。一种蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法，包括以下步骤：a.重组蛋白质结构域分离纯化；b.制备线性生物大分子底物溶液；c.重组蛋白质结构域与线性生物大分子底物混合反应；d.荧光探针ANS结合反应；e.荧光强度测定。步骤a中重组蛋白质结构域选用GST-PPC融合蛋白。PPC结构域（Pre-PeptidaseC-terminaldomain）广泛分布于分泌型海洋细菌蛋白酶的C末端，特别是在海洋细菌和致病菌蛋白酶中较为多见。氨基酸序列分析及空间结构预测发现，PPC结构域表面存在大量疏水氨基酸残基。且前期研究表明，PPC结构域对胶原蛋白具有较强的吸附、膨胀作用，可与蛋白酶在胶原蛋白降解过程中产生协同作用。因此，我们选取两种氨基酸组成差异较大的PPC结构域作为本专利技术的研究对象（本专利技术不限于PPC结构域蛋白）。步骤b线性大分子底物选用猪来源可溶胶原蛋白中、角蛋白、羟甲基纤维素钠和木聚糖（本专利技术不限于上述大分子底物）。上述方法具体包括以下步骤：1）重组表达蛋白质结构域（GST-结构域融合蛋白）：重组表达GST-结构域融合蛋白，重组蛋白质结构域溶液最终浓度控制为0.5mg/ml。2）线性生物大分子底物溶液的制备：用PBS缓冲液（20mM,pH7.4）溶解线性大分子底物，终浓度为1mg/ml。3）分别取100µl重组蛋白质结构域（0.5mg/ml）和100µlPBS缓冲液（20mM,pH7.4）混合、100µl重组蛋白质结构域和100µl线性生物大分子底物（1mg/ml）混合，37ºC温浴5min。然后再加入1µl荧光探针ANS（8mM），扫描加入线性大分子前后重组蛋白质结构域混合溶液的荧光强度（激发波长为374nm，检测发射波长为485nm，每个样品设置三个平行，重复检测5次）。根据相互作用前后的相对荧光强度，判断重组蛋白质结构域与线性生物大分子之间疏水作用力的相对强弱。本专利技术的优点和有益效果本专利技术的优点在于建立一种新型检测蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的技术方法。具体体现如下：1、运用疏水荧光探针ANS快速检测蛋白质结构域与线性生物大分子物质的疏水相互作用。根据相互作用前后的相对荧光强度判断蛋白质结构域与线性生物大分子之间疏水作用力的相对强弱。2、结果稳定、重复性好，灵敏度高。3、与已有的蛋白相互作用技术相比，该方法具有操作简单、快速、成本低廉、需要蛋白质用量少等优点，直观显示蛋白质结构域与线性生物大分子底物疏水相互作用相对强度。4、该方法大大的缩短了实验周期，可实现对多种蛋白质结构域与线性生物大分子疏水相互作用进行高通量快速检测，具有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术方法检测两种PPC结构域重组蛋白与可溶性猪胶原蛋白的疏水相互作用；图2为本专利技术方法检测两种PPC结构域重组蛋白与可溶性角蛋白的疏水相互作用；图3为本专利技术方法检测两种PPC结构域重组蛋白与羟甲基纤维素钠的疏水相互作用；图4为本专利技术方法检测两种PPC结构域重组蛋白与木聚糖的疏水相互作用。横坐标为样品反应体系，纵坐标是相对荧光强度，以最高荧光值为100%。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例1：利用荧光探针ANS检测两种PPC结构域与可溶性猪胶原蛋白的疏水相互作用。所述的两种PPC结构域：ePPC结构域来源于Vibrioanguillarum分泌的胞外金属蛋白酶empAC末端PPC结构域；SPPC结构域来源于Salinivibriosp.YH4分泌的胞外丝氨酸蛋白酶YHSC末端PPC结构域。所述鳗弧菌（Vibrioanguillarum）菌株由本实验室分离得到（分离至渤海水样）；所述盐弧菌（Salinivibriosp.YH4）本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法，包括以下步骤：a. 重组蛋白质结构域分离纯化；b. 制备线性生物大分子底物溶液；c. 重组蛋白质结构域与线性生物大分子底物混合反应；d. 荧光探针ANS结合反应；e. 荧光强度测定。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质结构域与线性生物大分子相互作用的测定方法，包括以下步骤：a.重组蛋白质结构域分离纯化；b.制备线性生物大分子底物溶液；c.重组蛋白质结构域与线性生物大分子底物混合反应；d.荧光探针ANS结合反应；e.荧光强度测定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中使用的重组蛋白须具有表面疏水区。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中线性生物大分子包括大分子线性蛋白（胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白等）、线性多糖（淀粉、纤维素等）等。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法利用线性大分子底物与蛋白质结构域的相互作用，封闭蛋白质结构域表面的疏水区域，进而阻断疏水荧光探针ANS与蛋白表面疏水区结合。根据相互作用前后相对荧光强度的变化，来判断蛋白质结构域与线性生物大分子之间疏水作用力的强弱。5.根据权利要求1、2、3、4所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：何海伦，黄嘉丰，吴日帮，马昌杯，刘丹，张姜，廖斌强，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43