本发明专利技术涉及一种用于鉴定愈伤组织质量的方法，通过检测愈伤组织的相对荧光强度来鉴定愈伤组织的质量。本发明专利技术首次采用愈伤组织的生理指标作为判断愈伤组织质量的方法，将愈伤组织质量判断从常规表面观察，主观经验性的定性研究，推进到用仪器进行生理生化定量分析。本方法操作简单，而且能够准确地判断愈伤组织质量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物组织培养
，具体植物愈伤组织的检测及其应用。
技术介绍
目前我们对愈伤组织状态质量的判断都是基于观察得到的，也就是通过愈伤表面的形态观察，或者是通过愈伤组织的切片观察。组织形态观察简单方便需要非常丰富的经验，而且不同个体之间的判断结果差异比较大，有时表面状态并不一定代表生理状态因此出现误判，如我们在实验中就发现籼稻品种G44其外观符合胚性愈伤组织的特征但是转化率却极低。虽然切片观察能够更准确的从细胞水平判断，但是愈伤组织并不是均一的， 而是由不同质量状态的细胞组成，切片所取的样本量少，很难代表整个愈伤组织的整体状态，而且操作复杂。根据组织学观察、外观特征、愈伤组织的再生性和再生方式等，愈伤组织可分成两大类胚性愈伤组织(embryonic callus, EC)和非胚性愈伤组织(non-embryonic callus, NEC)。一般胚性愈伤组织质地较坚实，颜色有淡黄色或黄色，表面具球形颗粒，颗粒较脆，其生长缓慢；非胚性愈伤组织则表现出多种形态水质化，褐化，表面根/根毛状分化。从细胞形态特征来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小、原生质浓厚、无液泡、常富含淀粉粒、细胞核大、分裂活性强。非胚性细胞往往比较大、不规则形状、长形、易出现多核细胞。目前愈伤组织质量以组织形态观察为基础的，往往都是经验性的。至于愈伤组织形态结构的形成以及分子机理并不清楚。许多研究结果表明所观察的愈伤组织状态与其实际的生理状态并不完全相符合。例如，长时间培养的愈伤组织根据形态判定是为胚性愈伤组织，但这种愈伤组织却难以分化，甚至根本不能再生成为植株。愈伤组织的转化和分化的能力是不同的状态决定的(Lin, Y. J. and Q. F. Zhang (2005). Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice. Plant Cell Reports23(8) : 540-547.)，尚不清楚何种状态的愈伤组织适合于分化和遗传转化。现有的愈伤组织判定方法不能将不同生理功能的愈伤组织给予区分，因此，非常需要一种将愈伤组织质量研究从定性判断走向定量分析，更精确区分愈伤组织质量状态的生理生化分析方法，应用这种分析方法不仅能够判断愈伤组织是否适合进行遗传转化，而且有助于深入研究培养基组分对愈伤组织质量的影响，不同状态的愈伤组织基因表达的差异和表观遗传学机理。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述不足，提供一种鉴定愈伤组织质量的方法。本专利技术研究发现，愈伤组织的质量与其相对荧光值呈负相关，因而，可以通过检测愈伤组织的相对荧光值来评价愈伤组织的质量。本专利技术方法包括如下步骤将待检愈伤组织勻浆后，离心去上清，将沉淀悬浮于溶液中，测定其相对荧光值。上述待检愈伤组可以通过勻浆器勻浆，也可以通过人工研磨勻浆。勻浆时应将愈伤组织置于勻浆溶液中，例如NaCl溶液，在本专利技术实施例中采用IM的NaCl溶液，加入勻浆液的体积可以是愈伤组织体积的3飞倍，优选4倍。勻浆液通过离心去除上清，保留沉淀， 在13000-15000g下离心3-7min即可，优选14000g离心5min。沉淀用溶液重悬，例如用蔗糖溶液重悬，蔗糖溶液优选浓度为50%-80%，溶液的加入量按照上清等量(体积)加入。接着震荡使细胞壁碎片充分悬浮。再用溶液稀释5-10倍，例如用50%-80%的蔗糖溶液将悬浮液稀释10倍。上述荧光检测的激发光波长330-370nm，发射波长440-460nm，例如优选在360nm 激发光，445nm发射光下用荧光酶标仪读取相对荧光值。在本专利技术的一个优选实施实方式中，取200μ1加入96孔荧光板中，在360nm激发光，445nm发射光下用荧光酶标仪读取相对荧光值。在检测中可以使用3个样品重复，并且读取7-10次取平均值作为此愈伤组织的相对荧光值，以使得检测结果更加准确。本专利技术的所述的愈伤组织可以是任何植物愈伤组织，包括但不限于禾本科、早熟禾科、葱科、六出花科、石蒜科、夹竹桃科、棕榈科、菊科、小檗科、红木科、十字花科、凤梨科、 大麻科、石竹科、藜科、秋水仙科、葫芦科、薯蓣科、麻黄科、大戟科、豆科、唇形科、亚麻科、石松科、芭蕉科、蓝果树科、罂粟科、松科、蔷薇科、茜草科、杨柳科、茄科、紫杉科、茶科以及葡萄科等植物，例如在水稻及小麦等农作物上。本方法首次采用愈伤组织的生理指标作为判断愈伤组织质量的方法，将愈伤组织质量判断从常规表面观察，主观经验性的定性研究，推进到用仪器进行生理生化定量分析， 本方法操作简单，而且能够准确地判断愈伤组织质量。附图说明图1抗性愈伤组织PCR检测结果，检测目标基因为潮霉素，目标片段长度为CK为质粒对照。9，15，18为假阳性愈伤组织。图2抗性愈伤组织的⑶S染色结果CK为未转基因愈伤组织对照，6号为⑶S染色阴性愈伤。图3相对荧光值和转化效率之间的关系，转化率为潮霉素抗性&GUS染色阳性的愈伤组织数比上总共接种愈伤组织数。在相对荧光小于1500时转化率大约大于20%， 这时可以满足平时转化需求。转化率和相对荧光值之间存在着对数负相关，相关系数 R2=O. 8086。图4用相对荧光值分析愈伤组织在继代和诱导过程中质量变化情况。aill-yd: zhll 诱导；zhll-jd :zhll 继代；njx74-yd :njx74 诱导；njx74_jd :njx74 继代。图5籼稻生长在LY培养基上比生长在N6培养基上有着更高的质量，而粳稻质量相似，蓝色柱代表LY培养基，紫色柱代表N6培养基培养不同品种愈伤组织的相对荧光值。具体实施例方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。实施例1用相对荧光值分析转基因效率 1.1材料说明转基因实验选了 10种愈伤组织分别是Sll 1-1，ZHl 1-2，9311-1,9311-2，9311-3， Njx74-1, Njx74-2, YTA-I, YTA-2，YTA-3。其中 ZHl 1-1，9311-1，Njx74_l，YTA-1 是在 LY 培养基上诱导和继代的愈伤组织，ZHl 1-2, 9311-3，YTA-3是在N6培养基上诱导和继代的愈伤组织，9311-2，Njx74-2, YTA-2是在LY培养基上诱导但是在N6培养基上继代的愈伤组织。其中LY培养基购自武汉珞樱生物科技有限公司(LY培养基试剂盒包括LY培养基，LY-A 试剂，LY-B试剂等)。转基因菌株EHA105 转基因质粒pCAMBIA1301荧光检测取各种愈伤组织0. 5g加入aiil IM的NaCl溶液中，研磨至勻浆，14000g离心5min，其上清，沉淀用上清等体积的60% (W/V)蔗糖溶液重悬，接着震荡使细胞壁碎片充分悬浮。再用60% (W/V)蔗糖溶液将悬浮液稀释10倍。取200μ1加入96孔荧光板中，在 360nm激发光，445nm发射光下用荧光酶标仪读取相对荧光值。在检测中每个样品重复3次， 并且读取7-10次取平均值作为此愈伤组织的相对荧光值。1.2转基因方法诱导诱导培养基1，IL诱导培养基配制(根据需要等比例缩放)在1升的烧杯中加入800ml双本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．植物愈伤组织质量鉴定方法，其是通过检测愈伤组织的相对荧光强度来鉴定愈伤组织的质量。
【技术特征摘要】
1.植物愈伤组织质量鉴定方法，其是通过检测愈伤组织的相对荧光强度来鉴定愈伤组织的质量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法将待检愈伤组织勻浆后，离心去上清，将沉淀悬浮于溶液中，测定其相对荧光值。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，测定相对荧光值的条件是激发光波长 330-370nm,发射波长 440_460nm。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述激发光波长为360nm，发射光波长为 445nm。5.根据权利要求2、任一项所述的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：李阳，李阳生，丁博，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83
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