一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法技术

本发明专利技术公开一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，具体方法包括制备荧光磁性微球；制备荧光检测抗体；制备荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度获得实际蛋白质浓度，本发明专利技术将流式细胞术与荧光免疫磁性微球相结合检测蛋白质浓度，采用该方法进行特异性蛋白质分子浓度检测，反应体系小，测量更精准，检测下限为pg/ml级，具有较高的特异性和敏感性，操作更方便快捷，操作步骤简化，直接孵育无需分步孵育洗涤，缩短反应时间，检测结果时间更短，定量更精确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质浓度的定量检测方法，具体涉及一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法。
技术介绍
生物大分子是由结构简单相对分子量较低的有机化合物通过聚合而成的多分子体系，包括蛋白质、核酸、脂质以及糖类。生物大分子具有各种生物活性并在生物新陈代谢中发挥着重要的作用，故是构成生命的基础物质。特别是蛋白质，其是组成人体组织基本功能单位，是生命活动的主要承担者，同时通过复杂的结构特性发挥生物学功能，如提供生命需要的能量和物质、促进生长发育以及产生免疫功能等。对蛋白质的研究首先需要对蛋白质进行定量和定性研究。目前蛋白质定量测定的方法主要分为物理方法和化学方法，其中物理方法主要是紫外吸收法，化学方法主要是染料法、双缩脲发和酚试剂法。但是这些方法均检测的是总蛋白质的浓度，故存在不能特异性检测某一种蛋白质浓度的弊端。随着分子生物学的发展，人类从分子机制上阐明了疾病的发病机制，所以针对这些特异性蛋白分子的检测变得尤为重要。目前广泛应用于临床检验的指标中大部分是对特异性蛋白质分子的测定，包括各种酶类、自身抗原、自身抗体以及肿瘤标志物等。对于特异性蛋白质分子浓度的检测方法主要是通过免疫学方法中的酶联免疫吸附测定(ELISA)进行蛋白质的定量。该方法是将可溶性抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合特异性进行免疫反应的原理，再运用化学显色反应对其进行定性和定量检测方法。该方法具有快速、灵敏、简便以及载体易于标准化等优点，但具体操作步骤繁琐，每个反应体系只能检测一个指标，同时该方法的检测下限为ng/ml级。流式细胞术(FCM)在科学研究中具有同时在单一样品中检测和分析标记多种分子的特点，是一种高通量的在功能水平上对单列细胞或其它粒子进行逐个、多参数、快速、准确定量分析和分选的检测技术，该技术具有检测速度快、检测参数多、采集数据信息量大、分析全面、分选纯度高以及方法灵活等特性。该技术的迅速发展，主要取决于荧光染料强大特性，特别是不同的荧光标记或是不同强度的荧光都可以在流式细胞仪中分辨开。这种独特的性质，提示可以使用流式细胞仪在同一样品中同时检测多个不同标记的指标，从而达到快速和方便的检测目的。流式细胞仪主要用于细胞的表面标记检测与细胞分群，若要检测某一分子则必须要有其他粒子作为载体，且该载体大小必须是纳米级并具有良好的粒径均一度。目前在磁场辅助分离技术，特别是生物磁分离技术中应用比较成熟便是磁性微球，磁性微球材料便具备粒径大小均一、磁响应性强以及水中分散性好等特性。通过分析FCM技术相比于ECLIA具有更高的准确性和高通量检测特性，故可以将FCM快速、高通量、多参数和准确定量分析等特性应用于蛋白质浓度的检测，同时选择大小为纳米级、粒径均匀的磁性微球材料作为流式细胞仪的载体，建立荧光免疫磁性微球联合流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，将流式细胞术与荧光免疫磁性微球相结合检测蛋白质浓度，采用该方法进行特异性蛋白质分子浓度检测，反应体系小，测量更精准，检测下限为pg/ml级，具有较高的特异性和敏感性，操作更方便快捷，操作步骤简化，直接孵育无需分步孵育洗涤，缩短反应时间，只需2.5h便可完成检测，检测结果时间更短，定量更精确。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，具体包括以下步骤：步骤(1)：将荧光染料修饰在磁性微球上制备荧光磁性微球；步骤(2)：将荧光基团交联在蛋白质特异的单克隆抗体上制备荧光检测抗体；步骤(3)：将步骤(1)获得的荧光磁性微球表面进行氨基化和酰胺-羧基化修饰，再分别将该蛋白质不同荧光检测抗体对应表位的特异性单克隆抗体和特定荧光标记量的荧光检测抗体交联在活化的荧光磁性微球表面，制成荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；步骤(4)：制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度获得实际蛋白质浓度。上述任一方案优选的是，所述步骤(1)通过密胺树脂聚合的方法将荧光染料修饰在磁性微球上。上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中运用化学交联的方法将荧光基团交联在蛋白质特异的单克隆抗体上制备荧光检测抗体。上述任一方案优选的是，步骤(4)中制作标准品工作曲线的制作方法为使用步骤(3)获得的校准磁性微球、荧光免疫磁性微球和步骤(2)获得的荧光检测抗体联合流式细胞仪检测蛋白质不同浓度标准品对应的平均荧光强度，制作标准品工作曲线。本专利技术的有益效果是：提供一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法及其制备方法，联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，具体包括以下步骤：步骤(1)：将荧光染料修饰在磁性微球上制备荧光磁性微球；步骤(2)：将荧光基团交联在蛋白质特异的单克隆抗体上制备荧光检测抗体；步骤(3)：将步骤(1)获得的荧光磁性微球表面进行氨基化和酰胺-羧基化修饰，再分别将该蛋白质不同荧光检测抗体对应表位的特异性单克隆抗体和特定荧光标记量的荧光检测抗体交联在活化的荧光磁性微球表面，制成荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；步骤(4)：制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度获得实际蛋白质浓度，本专利技术方法将流式细胞术与荧光免疫磁性微球相结合检测蛋白质浓度，采用该方法进行特异性蛋白质分子浓度检测，反应体系小，测量更精准，检测下限为pg/ml级，具有较高的特异性和敏感性，操作更方便快捷，操作步骤简化，直接孵育无需分步孵育洗涤，缩短反应时间，只需2.5h便可完成检测，检测结果时间更短，定量更精确。附图说明图1为本专利技术不同标记荧光磁性微球的荧光显微镜照片。图2为本专利技术标记罗丹明123荧光磁性微球的激光扫描共聚焦显微镜照片。图3为本专利技术校正微球校正的流式细胞术图。图4为本专利技术流式细胞仪检测不同浓度BSA标准样的流式细胞术图。图5为本专利技术荧光磁性微球联合流式细胞仪检测BSA的标准曲线(0～8000pg/mL)。图6为本专利技术流式细胞仪检测未知BSA样品浓度的流式细胞术图。具体实施方式为了更好地理解与实施本专利技术，下面结合具体实施的例子对本发明做进一步详细的描述。一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，其特征在于：联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，具体包括以下步骤：步骤(1)：将荧光染料修饰在磁性微球上制备荧光磁性微球；步骤(2)：将荧光基团交联在蛋白质特异的单克隆抗体上制备荧光检测抗体；步骤(3)：将步骤(1)获得的荧光磁性微球表面进行氨基化和酰胺‑羧基化修饰，再分别将该蛋白质不同荧光检测抗体对应表位的特异性单克隆抗体和特定荧光标记量的荧光检测抗体交联在活化的荧光磁性微球表面，制成荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；步骤(4)：制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度获得实际蛋白质浓度。

【技术特征摘要】
1.一种流式细胞仪定量检测蛋白质浓度的方法，其特征在于：
联合荧光免疫磁性微球和流式细胞仪检测特异性蛋白质浓度，具体包
括以下步骤：
步骤(1)：将荧光染料修饰在磁性微球上制备荧光磁性微球；
步骤(2)：将荧光基团交联在蛋白质特异的单克隆抗体上制备
荧光检测抗体；
步骤(3)：将步骤(1)获得的荧光磁性微球表面进行氨基化和
酰胺-羧基化修饰，再分别将该蛋白质不同荧光检测抗体对应表位的
特异性单克隆抗体和特定荧光标记量的荧光检测抗体交联在活化的
荧光磁性微球表面，制成荧光免疫磁性微球和校准磁性微球；
步骤(4)：制作标准品工作曲线并通过未知样品平均荧光强度
获得实际蛋白质浓度。
2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王博，
申请(专利权)人：王博，
类型：发明
国别省市：陕西;61