本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体地涉及烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT‑β‑TUB及其应用，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术所获得的烟粉虱BT‑β‑TUB的178bp的核苷酸序列可作为今后研究烟粉虱的功能基因及在响应温度胁迫基因表达的内参基因。
BT gene beta TUB whitefly responses to different temperature stress expression and its application
The present invention relates to the field of molecular biology, in particular to BT gene beta TUB whitefly responses to different temperature stress expression and its application, the nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID No.1. The nucleotide sequence obtained by the invention of the whitefly BT beta TUB 178bp can be used as the future research of whitefly functional gene and reference gene in gene expression in response to temperature stress.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地涉及烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB及其应用。
技术介绍
烟粉虱(Bemisiatabaci(Gennadius))属节肢动物门，昆虫纲，半翅目，粉虱科，小粉虱属，又称棉粉虱或甘薯粉虱，是一类刺吸式口器的小型昆虫。烟粉虱主要通过取食植物汁液、诱发煤污病、传播植物病毒等方式危害蔬菜、花卉、棉花、烟草等农作物，并被IUCN列为全球100种最具威胁的入侵种之一。现已几乎遍及我国所有的省份。烟粉虱的最适发育温度为26～30℃，发育临界温度在10.8～12.5℃之间，致死高温区在37～42℃之间。17℃和35℃是烟粉虱正常生长发育的最低和最高的温度极限。较强的温度逆境适应能力是烟粉虱在世界范围内广泛分布的原因。随着温室效应的增加，全球气温正逐年增高，烟粉虱较强的温度逆境适应能力使其能逐渐扩大保护地面积，这为其抵御温度逆境、延续种群提供给了场所。内参基因(Endogenousreferencesgene)即内部参照，在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。然而，随着物种及实验条件的改变，一些内参基因的表达并非总是稳定的。因此内参基因的选择应根据具体实验条件和材料方法而定。现有的烟粉虱内参基因在不同温度处理条件下表达并不稳定，因此需要筛选出合适的内参基因满足相关实验需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供BT-β-TUB基因片段作为烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因的应用，其中，所述BT-β-TUB基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示：TGTCAGGAGTAACGACGTGTTTGAGGTTCCCTGGTCAGTTGAACGCTGATCTGAGGAAACTTGCCGTGAACATGGTACCCTTCCCCAGGTTGCACTTCTTCATGCCTGGATTCGCTCCTCTCACCTCCCGTGGTAGCCAACAATACAGAGCACTTACCGTTCCCGAA。根据本专利技术的具体实施方式，在检测上述BT-β-TUB基因片段是否作为内参基因在响应不同温度胁迫表达时，使用：BT-β-TUBF1：5′-TTCATGGTTGATAACGAAGC-3′；和BT-β-TUBR1：5′-GCACCAAGTTAGTCTGGAAT-3′。根据本专利技术的具体实施方式，烟粉虱BT-β-TUB基因167bp核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：(1)从烟粉虱成虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA：(2)设计引物：(3)以cDNA为模板，利用(2)所设引物，PCR扩增烟粉虱β-TUB内参基因的核苷酸序列片段；(4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pEASY-T载体上，然后转化到大肠杆菌感受态细胞Transl-T1，37℃平板培养过夜，蓝白斑筛选含β-TUB片段的阳性克隆子；(5)将(4)所获得的阳性克隆子进行序列测序，测序所得的序列在NCBI上BLAST分析比较，进而确定所得的核苷酸序列为烟粉虱的β-TUB片段序列。本专利技术还提供了烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术所获得的烟粉虱BT-β-TUB的167bp的核苷酸序列可作为今后研究烟粉虱的功能基因及在不同发育时期基因表达的内参基因。本专利技术选取的BT-β-TUB(β-微管蛋白基因)内参基因，通过相对定量PCR技术检测表明其在0℃(1h,3h,5h)，12℃(1h,3h,5h)，35℃(1h,3h,5h)，40℃(1h,3h,5h)，26℃(1h,3h,5h)；17℃(5d,10d,15d,20d,G1),21℃(5d,10d,15d,20d,G1)，32℃(5d,10d,15d,20d,G1),35℃(5d,10d,15d,20d,G1)，26℃(5d,10d,15d,20d,G1)等不同温度条件下均能稳定表达，为研究烟粉虱功能基因及响应不同温度胁迫表达奠定基础。本专利技术选取的β-微管蛋白基因在多个物种中的不同温度处理条件下均能稳定表达，以BT-β-TUB为内参基因，通过定量RT-PCR技术检测表明其在各种温度处理条件下的烟粉虱成虫内均能稳定表达，为研究烟粉虱功能基因及温度适应性表达奠定基础附图说明图1BT-β-TUB内参基因在烟粉虱不同温度胁迫条件表达状况；图2BT-β-TUB在烟粉虱不同温度胁迫条件的相对表达量。具体实施方式实施例1：烟粉虱内参基因BT-β-TUB在不同发育时期的表达分析1、不同温度胁迫条件下烟粉虱总RNA提取：分别取不同温度胁迫条件下烟粉虱的RNA沉淀充分溶解，-80℃保存以备用。2、烟粉虱cDNA合成；3、烟粉虱内参基因β-TUB引物合成：BT-β-TUBF1：5′-TGTCAGGAGTAACGACGTGTTTG-3′；BT-β-TUBR1：5′-TTCGGGAACGGTAAGTGCTC-3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。4、相对定量PCR扩增反应：反应体系为20μL：2×TransStartTMGreenqPCR10μL、ROA0.4μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.3μL、cDNA模板1.0μL、灭菌ddH2O8.0μL。5、相对定量PCR扩增程序：反应条件为：94℃30s；然后进行40个循环：94℃5s，60℃30s。6、相对定量PCR结果检测分析：1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，烟粉虱BT-β-TUB基因在不同温度胁迫条件下表达状况如图1；然后利用ImageLab3.0和SPSS软件分析表明BT-β-TUB内参基因在不同温度胁迫条件下均能稳定表达，差异不显著(P>0.05)如图2，说明该基因能用于今后研究烟粉虱功能基因及温度胁迫响应基因表达的内参基因。<110>中国农业科学院植物保护研究所<120>烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因BT-β-TUB及其应用<160>3<210>1<211>167<212>DNA<213>烟粉虱<400>1tgtcaggagtaacgacgtgtttgaggttccctggtcagttgaacgctgatctgaggaaac60ttgccgtgaacatggtacccttccccaggttgcacttcttcatgcctggattcgctcctc120tcacctcccgtggtagccaacaatacagagcacttaccgttcccgaa167<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ttcatggttgataacgaagc20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gcaccaagttagtctggaat20本文档来自技高网...
【技术保护点】
BT‑β‑TUB基因片段作为烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因的应用，其中，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.BT-β-TUB基因片段作为烟粉虱响应不同温度胁迫表达的内参基因的应用，其中，所述基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的烟粉虱BT-β-TUB基因片段作为在响应不同温度胁迫表达的内参基因的应用，其特征在于，在检测上述BT-β-TUB基因片段是否作为内参基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴恬美，吕志创，刘万学，万方浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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