近红外荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种近红外荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针的结构如式I所示。本发明专利技术提供的近红外荧光探针，具有良好的水溶性和细胞通透性、低细胞毒性、高H2S选择性、荧光增强性、快速响应等特点，对细胞、组织和小鼠中的内生H2S可以实时成像，能够实现对活体内生H2S的检测，进而用于肿瘤诊断。

Near infrared fluorescent probe and preparation method and application thereof

The invention discloses a near infrared fluorescent probe and a preparation method and an application thereof. Near infrared fluorescent probe provided by the invention has good water solubility and permeability, low toxicity, high selectivity, H2S fluorescence enhancement characteristics, rapid response, the cells and tissues in mice and endogenous H2S can be real-time imaging, can realize the detection of endogenous H2S in vivo, and for cancer diagnosis.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物硫化氢检测领域，更具体地，涉及一种近红外荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
H2S过去一直被认为是毒气，但是，最近研究表明内生H2S具有重要的生理功能，被命名为继一氧化氮和一氧化碳之后的第三气体递质。内生H2S可通过三种不同路径酶促生成，包括：胱硫醚-β-合成酶(CBS)，胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-MPST)/半胱氨酸氨基转移酶(CAT)。证据显示H2S影响多种生理学和病理学过程，包括血管张力调节和心脏保护，血管生成的内生刺激物和线粒体的生物能学。H2S在肿瘤生物学领域也扮演着重要的角色，有人认为抑制H2S的生物合成和提高H2S浓度超过一定的临界值会有抗癌效果。然而，H2S的药理学特性和涉及H2S的精确机制仍很不清楚。因此，在进一步研究H2S生物学以及H2S相关疾病的诊断方面，开发一种有效的内生H2S的体内可视化手段的作用是无可估量的。基于荧光的方法最近已成为原位和实时检测生物系统内H2S的有效方法。各种荧光探针已经成功地用于检测细胞内H2S。然而，用于体内生物成像的H2S荧光探针还是罕见的，尤其是用于包括癌症在内的H2S相关疾病的成像。用于组织或者个体中H2S成像的合适的荧光探针被认为能比较好地满足某些需求，如同时具有近红外(NIR)光学窗口、增强荧光性、快速和灵敏响应、高选择性、水溶性以及低细胞毒性。由于H2S加成对大共轭系统会产生干扰，亲核加成有机反应不适合于“turn-on”型近红外探针的开发。在近红外探针中，硝基的还原反应相对缓慢，而基于叠氮化物的近红外探针不能用于生物H2S的成像。对于近红外探针，硫解反应是理想的方法之一。然而，考虑到依据细胞类型不同，谷胱甘肽(GSH)的浓度会在1-15mM范围内变化，相对于毫摩尔级生物硫醇，二硝基苯基乙醚对于H2S的硫解选择性有限。综上，目前没有合适的用于体内生物成像的H2S荧光探针，因此，有必要开发一种能实现活体内内生H2S的生物成像的荧光探针，进而实现对活体内内生H2S的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种H2S荧光探针，通过荧光生物成像技术，该探针可以实现对活体内生H2S的检测。为了实现上述目的，本专利技术提供一种近红外荧光探针，该荧光探针的结构如式I所示(以下简称探针I)。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种近红外荧光探针的制备方法，该方法包括：(1)在惰性气体和第一有机溶剂存在下，将式II所示化合物与哌嗪接触反应；得到式III所示化合物；(2)在惰性气体、第二有机溶剂和碱性缩合剂存在下，将式III所示化合物与NBD-Cl接触反应；得到式I所示近红外荧光探针。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供所述的近红外荧光探针在内生H2S荧光生物成像中的应用。通过上述技术方案，本专利技术提供的近红外荧光探针，具有良好的水溶性和细胞通透性、低细胞毒性、高H2S选择性、增强荧光(87倍)、快速响应等特点，对细胞、组织和小鼠中的内生H2S可以实时成像，能够实现对活体内生H2S的检测，进而用于肿瘤诊断。本专利技术的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本专利技术示例性实施方式进行更详细的描述，本专利技术的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。图1示出了探针I的HRMS光谱图。图2示出了用H2S处理探针I后的HRMS光谱图。在室温下，将10μL10mM探针I的DMSO溶液与10μL100mMNa2S的水溶液在80μL50mMPBS(pH7.4，含10％DMSO)中共孵育1h。然后将反应混合物不经纯化即进行ESI-MS检测。图3示出了10μM探针I与200μMH2S在PBS缓冲液(50mM，pH7.4，含10％DMSO)中的时间依赖紫外可见光谱图。图4示出了探针I的荧光强度光谱图。图5示出了探针I与不同生物物质的相对荧光强度图。图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F分别示出了探针I检测bEnd.3活细胞中外源H2S的共聚焦显微镜图。图7A、图7B、图7C分别示出了探针I对小鼠外生H2S进行检测的肉眼可视化荧光成像图。图7A为对空白小鼠荧光成像图；图7B为对小鼠腹腔注射200μL150μM探针I后的荧光成像图；图7C为小鼠腹腔注射200μL150μM探针I30min后，再腹腔注射200μL150μMNa2S后的荧光成像图。图8示出了与不同浓度探针I孵育的细胞的存活率。其中，每组浓度下，左侧柱表示孵育0.5h，右侧柱表示孵育1h。图9(a)、图9(b)、图9(c)、图9(d)、图9(e)和图9(f)分别示出了探针I检测bEnd.3活细胞中内生H2S的共聚焦显微镜图，图9(g)示出了bEnd.3细胞的成管能力共聚焦显微镜图，图9(h)示出了50μMD-Cys刺激bEnd.3细胞12h后的成管能力共聚焦显微镜图，图9(i)示出了150μMD-Cys刺激bEnd.3细胞12h后的成管能力共聚焦显微镜图；图9(j)示出了0μM、50μM、150μMD-Cys刺激bEnd.3细胞30min后，再与探针I孵育30min后的细胞荧光统计图；图9(k)示出了0μM、50μM、150μMD-Cys刺激bEnd.3细胞12h后的管长度统计图。图10示出了探针I对小鼠内生H2S进行检测的肉眼可视化荧光成像图。a组为对小鼠静脉注射200μL150μM探针I后的荧光成像图；b组为对小鼠腹腔注射200μL150μMD-Cys30min后，再静脉注射200μL150μM探针I后的荧光成像图。图11A、图11B、图11C和图11D分别示出了探针I在小鼠的肝脏和肾脏组织中的荧光成像图。图11E示出了图11A-图11D中组织的平均区域荧光强度。图11F示出了小鼠肝脏和肾脏中产生H2S的酶的表达水平。图12示出了探针I检测FHC、HCT116和HT29细胞的内生H2S的荧光显微镜图。其中，图12A表示FHC细胞仅与10μM探针I孵育；图12B表示FHC细胞与1mMZnCl2预孵育30min然后与10μM探针I孵育30min；图12C为HCT116细胞仅与10μM探针I孵育；图12D表示HCT116细胞与1mMZnCl2预孵育30min然后与10μM探针I孵育30min；图12E表示HT29细胞仅与10μM探针I孵育；图12F表示HT29细胞与1mMZnCl2预孵育30min然后与10μM探针I孵育30min；图12A’-12F’分别为图12A-12F的明场与荧光叠加图。图13a示出了图12A、图12B、图12C、图12D、图12E、图12F的细胞荧光统计图；图13b示出了FHC、HCT116、HT29细胞中产生H2S的酶的表达水平；图13c示出了探针I对小鼠肿瘤模型进行检测的肉眼可视化荧光成像图，左图为对小鼠肿瘤皮下注射终浓度为10μM探针I后的荧光成像图，右图为小鼠肿瘤模型的明场图；图13d示出了图13c中肿瘤的平均区域荧光强度。具体实施方式下面将参照附图更详细地描述本专利技术的优选实施方式。本专利技术提供了一种近红外荧光探针，该荧光探针的结构如式I所示。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种近红外荧光探针的制备方法，该方法包括：(1)在惰性气体和第一有机溶剂存在下，将式II所示化合物与哌嗪接触反应；得到式III所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种近红外荧光探针，其特征在于，该荧光探针的结构如式I所示。

【技术特征摘要】
1.一种近红外荧光探针，其特征在于，该荧光探针的结构如式I所示。2.一种近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括：(1)在惰性气体和第一有机溶剂存在下，将式II所示化合物与哌嗪接触反应；得到式III所示化合物；(2)在惰性气体、第二有机溶剂和碱性缩合剂存在下，将式III所示化合物与NBD-Cl接触反应；得到式I所示近红外荧光探针。3.根据权利要求2所述的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，式II所示化合物与哌嗪的摩尔比为1:2-5。4.根据权利要求2所述的近红外荧光探针的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张强哲，易龙，席真，李鲁远，张坤，张捷，翟蓓蓓，古向向，
申请(专利权)人：南开大学，北京化工大学，
类型：发明
国别省市：天津;12