一种使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法技术

本发明专利技术提供一种使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法，包括以下步骤：（1）提取牦牛胚胎组织的总RNA，反转录为cDNA；（2）使用多个内参基因，分别设计特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，得到Ct值；（3）根据步骤（2）获得的Ct值，用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件筛选出最稳定的内参基因组合；（4）将步骤（3）获得的内参基因组合和目的基因一起进行qRT‑PCR反应，计算目的基因在各组织中的相对表达量。应用本发明专利技术的方法从多个内参基因中筛选出牦牛胚胎各组织中表达最稳定的内参基因，弥补了单一内参基因的不足，对推动牦牛生物技术研究方法的改进具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种使用多内参基因组合进行实时荧光定量PCR研究牦牛胚胎基因的方法，尤其涉及研究牦牛胚胎器官发育和低氧适应相关功能基因的方法。
技术介绍
牦牛(Bosgrunnien)是能在高海拔地区生存并延续至今的稀有牛种，能在高寒、缺氧、牧草生长期短等极为恶劣的环境下生活自如、繁衍后代，为牧民提供奶、肉、毛、役、燃料等生产和生活资料，具有“高原之舟”的美称。牦牛生活在以我国青藏高原为中心，围绕喜马拉雅山、帕米尔、昆仑山、天山、阿尔泰山等几大山脉向外延伸的地区。中国的牦牛分布在青海省、西藏藏族自治区、四川省、甘肃省、新疆维吾尔族自治区和云南省，中国的牦牛数量占世界牦牛总数的92%。经过长期的自然选择和进化，牦牛的各器官在胚胎发育时期就已经从生化和形态学上获得了稳定的适应高原低氧的遗传学特征和独特机制，因此研究胚胎期牦牛器官中低氧适应相关的功能基因需进一步挖掘和鉴定。目前常用于检测基因表达水平的方法有DNA微阵列(DNAmicroarray)、Northern印迹(northernblot)、原位杂交(insituhybridization,ISH)和实时定量PCR(quantitativereal-timepolymerasechain,qRTPCR)等。其中，qRT-PCR在定量分析mRNA表达中具有灵敏性高、特异性强、快速准确、操作简单、成本较低等特点，被广泛应用于分子医学、生物科学、微生物学以及诊断学等领域。然而qRT-PCR对RNA的质量和完整性以及模板cDNA的质量和数量、引物的特异性、扩增效率、内参基因的选择等要求严格(Bustin,2000;VanGuilderetal.,2008)。选用一种合适的内参基因对目的基因的表达量进行校正可以提高该方法的灵敏度和重复性。理想的内参基因应该在任何实验环境和条件下均能稳定表达，然而许多研究表明任何一种内参基因在所有的试验条件下的表达都不稳定，在不同组织、不同发育阶段或不同环境胁迫等条件下，内参基因的表达量存在差异。因此，在进行基因表达分析之前应确定稳定表达的管家内参基因对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种成本低、操作简便的使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法。本申请人选择10个在家畜不同器官组织以及器官在不同发育时期稳定表达的内参基因（ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA、PPIA、UBE2D2、SDHA和TBP）（Bionazetal.,2007;Karenetal.,2005），以筛选一个通用的牦牛内参基因检测引物，来满足牦牛低氧适应相关的功能基因功能研究的需要。本专利技术提供一种使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法，包括以下步骤：（1）提取牦牛胚胎组织的总RNA，反转录为cDNA；（2）使用多个内参基因，分别设计特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，得到Ct值；（3）根据步骤（2）获得的Ct值，用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件筛选出最稳定的内参基因组合；（4）将步骤（3）获得的内参基因组合和目的基因一起进行qRT-PCR反应，计算目的基因在各组织中的相对表达量。作为优选，步骤（2）中所述多个内参基因为：ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA、PPIA、UBE2D2、SDHA和TBP。作为优选，步骤（2）中所述实时荧光定量PCR反应体系为：SYBRPremixExTaqTM10µl上游引物S（20mmol·L-1）0.8µl下游引物A（20mmol·L-1)0.8µlddH2O7.4µlcDNA模板1µl。作为优选，步骤（2）中所述实时荧光定量PCR反应程序为：95℃30s，95℃5s，55℃30s，40个循环后进入溶解曲线程序。作为优选，步骤（3）中筛选得到的最稳定的内参基因组合为ACTB和TBP。本专利技术还提供用于研究牦牛胚胎基因的多内参基因组合，所述多内参基因组合为ACTB和TBP。本专利技术从多个内参基因中筛选出牦牛胚胎各组织中表达最稳定的内参基因，数据真实可靠。筛选出的多内参基因组合研究方法弥补了现有的单一内参基因可能导致实验结果有偏差甚至错误的不足，利用此方法可以准确的鉴定牦牛胚胎各器官中基因的表达丰度，为牦牛胚胎组织发育和低氧适应相关功能基因表达的精确定量数据提供有力支持，对于推动牦牛生物技术研究方法的改进具有重要意义。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为GeNorm通过成对变异系数(Vn/Vn+1)确定最适合的内参基因的数目；图2为GeNorm软件计算出的各内参管家基因表达稳定值；图3为各基因的熔解曲线；图4为SYNJ1基因在牦牛胚胎不同组织中的表达量。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。试剂：TRizol试剂：美国Life公司；PrimeScript®RTreagentKitwithgDNAEraser：Takara公司；SYBR®II(PerfectRealTime)：Takara公司；引物合成：美国life公司。主要仪器和设备：PCR仪：Bio-rad公司；CFX-96型荧光定量PCR仪：Bio-rad公司；Nanodrop2000超微量分光光度计：ThermoScientific公司。实施例1本专利技术的一种使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的步骤如下：1、特异性引物的设计与合成选取长哺乳动物常用的10个的内参基因：ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA、PPIA、UBE2D2、SDHA和TBP作为内参基因的候选基因，根据所选内参基因序列用PrimerPremier5软件设计出相应的特异性引物，由美国Life公司合成。具体如表1所示。表1候选内参基因的引物2、采集样品，从组织样品中提取总RNA并检测RNA纯度和浓度（1）屠宰母牛后迅速采集牦牛胚胎的心脏、肝脏、肺、脾、肾和头部皮肤组织，存放于液氮中；（2）取100mg组织，用液氮磨成粉末装入1.5m1的EP管，加入1mlTRizol，充分混匀，室温放置5min；（3）4℃12000×g，离心10min。取上清，转移到新的无RNase的新离心管中，加入0.2mL氯仿，盖好盖后，用手剧烈震荡15s，室温放置3min。4℃11000×g离心15min，样品分层，把水相约600μl转移至新管中；（4）在得到的水相中加入500μl异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃11000×g离心10min，去上清；（5）加入1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7500×g离心5min；（6）去上清，置空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀。用无RNase水重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟；（7）用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28SrRNA量为18SrRNA的两倍左右，说明RNA完整性好；利用Nanodrop2000超微量分光光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提取牦牛胚胎组织的总RNA，反转录为cDNA；（2）使用多个内参基因，分别设计特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，得到Ct值；（3）根据步骤（2）获得的Ct值，用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件筛选出最稳定的内参基因组合；（4）将步骤（3）获得的内参基因组合和目的基因一起进行qRT‑PCR反应，计算目的基因在各组织中的相对表达量。

【技术特征摘要】
1.一种使用多内参基因组合研究牦牛胚胎基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提取牦牛胚胎组织的总RNA，反转录为cDNA；（2）使用多个内参基因，分别设计特异性引物进行实时荧光定量PCR反应，得到Ct值；（3）根据步骤（2）获得的Ct值，用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件筛选出最稳定的内参基因组合；（4）将步骤（3）获得的内参基因组合和目的基因一起进行qRT-PCR反应，计算目的基因在各组织中的相对表达量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述多个内参基因为：ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA、PPIA、UBE2D2、SDH...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓云，褚敏，丁学智，梁春年，郭宪，王宏博，裴杰，包鹏甲，阎萍，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62