标记河豚毒素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用同位素［３］↑Ｈ标记的河豚毒素（简称：［３］↑Ｈ－ＴＴＸ）产品。［３］↑Ｈ－标记河豚毒素产品是基础生物学研究和医学研究重要的生化试剂。同时也是河豚毒素产品作为使用药物进入临床应用前，必须使用的研究用试剂产品。该产品作为证实河豚毒素药物在体内分布、药物代谢、药物残留，以及药代动力学等一系列研究中有着不可替代的位置。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及放射标记的河豚毒素及其在生物学、医学和药学特别是药代动力学、药学研究用试剂中的应用，特别涉及标记河豚毒素的制备方法以及它在器官和组织放射自显影试剂中的应用。
技术介绍
河豚毒素产品，由于其独特的药理作用，受到了人们的广泛的关注和重视。早在20世纪三十年代，就已有人用粗制河豚毒素提取物，进行生物碱类药物成瘾性综合症(俗称“戒毒”)的临床治疗。在中草药大词典中也有关于以河豚籽入药的词条。在以后的几十年来，国内外不断有使用河豚毒素治疗诸如镇痛、戒毒、镇静等等的报道。但迄今为止河豚毒素还未被作为正式临床用药而获批准。综观其主要原因，是因为对河豚毒素的药理学研究、药理学作用原理和药代动力学分析等还不够充分明确。因而制约了河豚毒素作为正式临床用药的发展。河豚毒素若将作为正式获得批准的临床用药，就必须完成理化分析、药理学试验、药效学研究等等一系列大量的科学实验研究。河豚毒素本身是一个剧毒物质(LD50＝10ug/kg腹腔注射)。因而在药物试验过程中的使用剂量是极低的，若药物再分布到机体的各器官组织中时，其药物含量是无法用常规的仪器和检测手段来进行准确分析测定。因此，一般传统的药理学试验方法，根本无法完成药理、药效学研究中，药物代谢、药物在体内的分布和药物残留等一系列必须完成的试验分析。有人曾报道采用数学模拟计算的方法，得到药物动力学的试验结果。(颜松民海洋药物杂志，1985；2.)但该方法仅能通过计算死亡机率，来求证药物动力学。它不能证实药物的代谢、分布和残留等重要问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决采用一般传统的药理学试验方法，根本无法完成河豚毒素在药理、药效学研究中的药物代谢、药物在体内的分布和药物残留等一系列必须完成的试验分析的问题，提供一种标记河豚毒素产品及其制备方法和在动物体内给药后、确定河豚毒素在体内分布、代谢及药物残留的检测中的应用。本专利技术提供的标记河豚毒素，是以同位素3H标记河豚毒素，即其中至少一个氢原子被3H取代。本专利技术包括一、标记河豚毒素的制备1)精确称取待标记的河豚毒素产品；2)加入精确称取的催化剂5％钯—炭，其加入量按重量计为，待标记物∶催化剂＝1∶2-2.5；3)按重量体积比mg/ml加入二氧六环1∶0.1-1和2.5％HCl甲醇溶液0.1-0.5；4)将上述试剂置于同一反应瓶中，并连接到真空系统上，用液氮冷却反应瓶；5)将系统抽真空至10-3mmHg，通入与待标记物对应的、丰度为1-5％氚—氢混合气体，通入量为1∶1ml 1-5％氚—氢混合气体；6)通入氚—氢气体后，解冻反应瓶，在室温条件下搅拌反应4小时；7)反应结束后，将剩余的氚—氢回收到铀粉瓶内；8)从氚化系统上取下反应瓶，将反应液减压抽滤干燥；9)用热水洗干燥物，抽滤除去热水；每次用热水1-5倍，重复3~5次，以除去不稳定的氚；10)经热水洗后的干燥物，使用1∶1pH＝4.5的柠檬酸盐水溶液溶解滤去不溶物，将标记物调整为1mg/ml，即得标记河豚毒素产品。本法所制备的3H-河豚毒素产品为无色透明液体，产品每毫升含3H-河豚毒素1mg，每毫升含相当于1个毫居里的放射性，产品经薄层检测与未标记河豚毒素相同，标记后河豚毒素与未标记河豚毒素生物活性一致。二、标记河豚毒素的检测1、薄层(纸层析)层析色谱法按常规方法制备薄层硅胶板和纸板，将河豚毒素产品和标记河豚毒素产品分别点样，点样前样品需经事先预处理。(处理方法为分别取3H-TTX和TTX样品各100μl。加入100μl 1.5N NaOH加热水解，40分钟后，立即点样、展开。)用展开剂展开(展开剂为正丁醇+醋酸+水＝4∶1∶2)用紫外光检测230nm光斑位置，或将展开后硅胶板到160℃烘干20分钟，检测斑点。结果显示标记河豚毒素产品与未标记产品薄层展开位置相同，说明二者无明显区别。2、放射性测定为测定3H标记物对河豚毒素的标记结果，分别量取3H-TTX500μl(1μg/ml标记河豚毒素)和1μg/ml TTX样品500μl，各加入通用闪烁计数液4.5ml混匀后进行液闪计数，以通用闪烁计数液作为测定本底，测定结果为标记河豚毒素γ-液闪计数90631未标记河豚毒素γ-液闪计数21结果证实标记河豚毒素产品已标记3H标记物。3、LD50(半致死剂量测定)采用改良寇氏法(陈奇；中药药理研究方法人民卫生出版社1994；114)分别对标记河豚毒素产品和未标记河豚毒素产品进行LD50测定，测定结果为3H-TTX LD50＝10.30μg/kgTTX LD50＝10.87μg/kg二者结果显示标记后河豚毒素产品与标记前河豚毒素产品结果基本一致，表明河豚毒素在用3H标记后产品生物活性未改变。三、标记河豚毒素在动物体内给药后、确定河豚毒素在体内分布、代谢及药物残留的检测中的应用选取一组动物小鼠，以标记河豚毒素1μg/ml注射小鼠，肌肉注射140μl/只；分别在第一天给药后，于第2、3、4、5、6、7天按上步给药一次，同时逐日处死部分动物；采集已处死的各部分动物组织器官；将各器官组织0.5g，加入0.5ml通用闪烁液，用玻璃研磨器分别各自充分研磨组织，研磨至浆状，放入炮弹管内高速离心，12000转/分，2分钟；吸取离心后上清0.5ml，再加入通用闪烁液4.5ml，用γ-液闪仪计数，得出各组织器官分布、残留河豚毒素的结果。(见附表)，该试验结果显示3H-标记河豚毒素(3H-TTX)对组织、器官具有特异性亲合作用，因此可以作为制备用于组织和器官放射自显影试剂，用于准确、直观的定位河豚毒素在体内的分布、残留、积累，以及河豚毒素在体内的代谢状况，从根本上解决了分析河豚毒素药品的药代动力学时，所需使用样品的微剂量问题，同时，标记河豚毒素还可以通过同位素示踪的方法，了解河豚毒素的作用靶向器官，为研究河豚毒素的戒毒、镇痛机理等，提供了强有力的实验手段及所需的试剂。本专利技术的优点和积极效果本专利技术所公开的标记河豚毒素产品可利用药代动力学原理，证实河豚毒素药物在体内分布、药物代谢、药物残留及药物与疗效之间的关系等一系列使用其它试验手段而无法解决的相关课题。本专利技术产品，可以准确、直观的定位河豚毒素在体内的分布、残留、积累，以及河豚毒素在体内的代谢状况。从根本上解决了分析河豚毒素药品的药代动力学时，所需使用样品的微剂量问题。同时，标记河豚毒素还可以通过同位素示踪的方法，了解河豚毒素的作用靶向器官，为研究河豚毒素的戒毒、镇痛机理等，提供了强有力的实验手段及所需的试剂。具体实施方式实例1、一、标记河豚毒素的制备1)精确称取河豚毒素50mg(约为0.00017mg分子)和5％钯—炭催化剂120mg置反应瓶中；2)再加入25ml二氧六环和12ml 2.0％Hcl甲醇溶液；3)将反应瓶与真空系统连接，用液氮容器冷冻反应瓶，同时将反应瓶抽真空至10-3mmHg，这时通入50ml丰度为1-5％氚—氢混合气体；4)解冻反应瓶，在室温条件下用磁力搅拌器，搅拌反应4小时；5)反应结束，将剩余氚气回收到铀粉瓶内保存；6)从真空系统上取下反应瓶减压蒸发至干，用热水80℃ 10ml洗干燥物3次(每次用抽滤方法除去热水)；7)pH＝4.5柠檬酸盐溶液50ml，溶解干燥物；抽滤除去残渣得标记河豚毒素产品50ml。(1mg/ml)该标记河豚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种标记河豚毒素，其特征是以同位素［３］↑Ｈ标记河豚毒素，即其中至少一个氢原子被［３］↑Ｈ取代。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈家童，苏同芳，梁同春，孙存祯，林平生，贺秉军，王同顺，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]