季铵盐化荧光碳点的制备方法及其在抗菌和区分革兰氏阳性菌/阴性菌方面的应用技术

本发明专利技术提供了一种季铵盐化荧光碳点的制备方法及其在抗菌和区分革兰氏阳性菌/阴性菌方面的应用。其中，所述季铵盐化荧光碳点的制备方法主要包括两步，首先制得表面氨基化的碳点，然后在氨基化碳点表面接枝烷基甜菜碱，得到季铵盐化碳点。所制得的季铵盐化碳点具有良好的水溶液分散性和低细胞毒性，并能够有效抑制和杀死革兰氏阳性菌。此外该季铵盐化碳点具有优良的荧光性质，能够有选择性地使革兰氏阳性菌成像，从而可以有效区分革兰氏阳性菌和阴性菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纳米材料和纳米医学领域，尤其是水溶性碳点表面季铵盐化及其在抗菌及细菌鉴选领域的应用。
技术介绍
近年来，随着抗生素的发展和普及应用，由细菌感染引起的一些病症在很大程度上得到抑制。但由于一些复杂的机理，病原体可以破坏宿主的免疫系统使其产生运输障碍，使得抗生素等小分子抗菌剂不能有效到达患处抑制病菌；与此同时由于抗生素的滥用，细菌的耐药性也引起了广泛的关注，因此开发新型抗菌试剂是现如今面临的紧迫挑战。此外，细菌按照革兰氏染色法可以分为革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌，两者在细胞壁结构上面存在很大差异。区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择相应抗生素进行治疗方面意义重大。而传统的革兰氏染色法需要用肉眼通过显微镜观察，经常会出现视觉误差，而且操作过于复杂。这就迫切需要我们发展简便、准确的区分革兰氏阴性菌和阳性菌的方法。而伴随着纳米材料的兴起，纳米材料由于其可修饰性、量子尺寸效应、可通过血脑屏障、透过肾小球血管壁进入尿液(要求小于20nm)等性质使其在生物医药相关领域得到广泛关注。碳基材料由于其良好的生物相容性、低廉的原料、良好的光学性质等优良特点而受到广泛的关注。近年来，各种各样的碳材料(如碳纳米管、石墨烯、富勒烯等)被广泛地应用于生物检测、催化、能源、电子器件以及载药等方面。而荧光碳点作为一种新型的零维的碳材料(<5nm)，具有良好的水溶性、较高的量子产率、易表面修饰的特点，为其在抗菌或抗癌药物载体方面提供了可行性。另一方面，季铵盐类化合物具有抗菌性能已经被广为人知。烷基甜菜碱(N-alkylbetaine)就是其中的一种重要的季铵盐类化合物，它的四级N原子(quaternarynitrogenatom)上连接有不同碳原子个数的长链烷基。烷基甜菜碱一方面能够通过季铵盐的正电荷吸附在带负电的细菌表面，从而破坏细菌表面的离子平衡；另一方面可以通过长链烷烃插入细菌细胞壁或细胞膜而在细菌表面打孔，进而导致细菌内容物流出并杀死细菌。然而由于游离的季铵盐型抗菌剂净电荷密度小，其抗菌效果也得到限制。
技术实现思路
专利技术目的：一个目的是提供一种季铵盐化荧光碳点的制备方法，以解决现有技术存在的上述问题。进一步的目的是提供一种季铵盐化荧光碳点在细菌鉴别和抗菌方面的应用。技术方案：一种季铵盐化荧光碳点的制备方法，包括如下步骤：步骤1、向甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，在水热反应釜中反应12小时以上，反应温度为240-280℃；冷却至室温后离心、透析，得到纯化的氨基化碳点水溶液；步骤2、用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化烷基甜菜碱，并将活化后的烷基甜菜碱与氨基化碳点水溶液混合，室温反应4小时以上；透析处理后得到纯化的季铵盐化碳点。优选的，所述步骤1中，二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为5～30％。优选的，所述烷基甜菜碱为十二烷基甜菜碱、十四烷基甜菜碱、十六烷基甜菜碱或十八烷基甜菜碱。优选的，在步骤2中，所述烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为2:1～10:1。优选的，步骤2中的活化过程进一步为：向2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液中加入摩尔比为1:10:20的烷基甜菜碱、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下活化0.5±0.1小时；按照烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的物质的量比为5:1的比例加入氨基化碳点，室温反应4±0.5小时。一种季铵盐化荧光碳点在抗菌及区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的应用。优选的，所述季铵盐化荧光碳点的制备方法包括如下步骤：步骤1、向甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，在水热反应釜中反应12小时以上，反应温度为240-280℃，冷却至室温后离心、透析，得到纯化的氨基化碳点水溶液；步骤2、用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化烷基甜菜碱，并将活化后的烷基甜菜碱与氨基化碳点水溶液混合，室温反应4小时以上，透析处理后得到纯化的季铵盐化碳点。在所述步骤1中，二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为5～30％。在步骤2中，所述烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为2:1～10:1。一种季铵盐化荧光碳点在抗菌及区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的应用。有益效果：本专利技术的季铵盐型碳点具有对革兰氏阳性菌有较好的抗菌性质、良好的水溶性及荧光特性。本专利技术主要具有以下优势：(1)季铵盐化碳点制备过程简单、产量大、成本低。(2)该季铵盐化荧光碳点具有对革兰氏阳性菌有良好的杀菌、抑菌效果，在较高浓度下对革兰氏阴性菌有一定的抑菌效果，因此可针对性地用于治疗革兰氏阳性菌感染引起的疾病，避免过度使用广谱抗菌药对细菌造成耐药性。(3)较小尺寸的碳点作为抗菌试剂，可以透过肾小球血管壁进入尿液进而排出体外，从而将抗菌药物的副作用降低到最小。(4)低细胞毒性。对正常肺细胞(AT-II)的MTT结果显示，CD-12在60μg/mL的浓度下，细胞仍然有90％左右的存活率，这保证了该抗菌试剂在体内的应用潜力。(5)良好的荧光性能。该季铵盐化碳点具有良好的荧光性质，在特异性杀死革兰氏阳性菌的同时可实现对细菌的多色(红色、绿色和蓝色)成像，而对革兰氏阴性菌的抑菌效果较弱，且不能成像。说明书附图图1a和图1b分别为季铵盐化荧光抗菌碳点制备的流程图和反应原理示意图。图2a和图2b分别为季铵盐化荧光抗菌碳点(CD-12)的透射电镜图及对应的粒径分析图。图3为季铵盐化荧光抗菌碳点(CD-12)对大肠杆菌(革兰氏阴性菌代表)细菌毒性试验测试结果。图4为季铵盐化荧光抗菌碳点(CD-12)对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌代表)细菌毒性试验测试结果。图5为季铵盐化荧光抗菌碳点(CD-12)对正常肺细胞(AT-II)的MTT结果。图6为季铵盐化荧光碳点抗菌(CD-12)(30μg/mL)与金黄色葡萄球菌共同孵育2小时后的共聚焦荧光显微镜图。图7为季铵盐化荧光碳点抗菌(CD-12)(30μg/mL)与大肠杆菌共同孵育2小时后的共聚焦荧光显微镜图。具体实施方式实施例1氨基化碳点(AEEA碳点)的制备(反应原理见图1b)，包括以下步骤：步骤1.在甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷(AEEA)，搅拌混匀；步骤2.在水热反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、向甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，在水热反应釜中反应12小时以上，反应温度为240‑280℃；冷却至室温后离心、透析，得到纯化的氨基化碳点水溶液；步骤2、用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺活化烷基甜菜碱，并将活化后的烷基甜菜碱与氨基化碳点水溶液混合，室温反应4小时以上；透析处理后得到纯化的季铵盐化碳点。

【技术特征摘要】
1.一种季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、向甘油中加入二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷，搅拌均匀，在水热反应釜中反应12小时以上，反应温度为240-280℃；
冷却至室温后离心、透析，得到纯化的氨基化碳点水溶液；
步骤2、用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化烷基甜菜碱，并将活化后的烷基甜菜碱与氨基化碳点水溶液混合，室温反应4小时以上；
透析处理后得到纯化的季铵盐化碳点。
2.如权利要求1所述的季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的体积分数为5~30%。
3.如权利要求1所述的季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述烷基甜菜碱为十二烷基甜菜碱、十四烷基甜菜碱、十六烷基甜菜碱或十八烷基甜菜碱。
4.如权利要求1所述的季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，在步骤2中，所述烷基甜菜碱与制备氨基化碳点的原料二乙烯三胺基丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为2:1~10:1。
5.如权利要求1所述的季铵盐化荧光碳点的制备方法，其特征在于，步骤2中的活化过程进一步为：
向2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲溶液中加入摩尔比为1:10:20的烷基甜菜碱、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下活化0.5±0.1小时；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴富根，杨婧婧，张晓东，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32