巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法技术

本发明专利技术公开了一种巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，属于巨尾桉广林29的组培快繁领域。本发明专利技术巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，包括：(1)将巨尾桉广林29适宜的外植体消毒，接种到腋芽诱导培养基，诱导腋芽萌发；(2)将萌发的腋芽接种到增殖培养基，诱导丛生芽；(3)将丛生芽中的单个芽接种到生根培养基，诱导生根，获得完整再生植株。本发明专利技术通过改良增殖培养阶段的激素组合，加入适量KT并筛选获得最佳增殖培养基，建立了桉树茎尖脱毒快速扩繁体系，大大促进了不定芽的增殖和生长，不仅增殖效率高，增殖时间短，而且芽苗生长健壮、整齐度高，为广29桉树的大规模工厂化育苗造林及遗传转化再生系统的建立等奠定了基础。

Detoxification and rapid propagation method of stem apex of Eucalyptus grandis 29

The invention discloses a method for detoxification and rapid propagation of Eucalyptus urophylla 29 stem apex, belonging to the field of tissue culture and rapid propagation of Eucalyptus grandis plantation forest 29. The invention of eucalyptus forests 29 shoot tip detoxification and rapid proliferation of methods, including: (1) the eucalyptus forest wide explant 29 suitable, inoculated into axillary bud induction medium, inducing axillary bud germination; (2) the germination of axillary buds were inoculated into the culture medium of proliferation, bud induction (; 3) the single bud bud clumps in the rooting medium, rooting, the regenerated plants. The present invention by improving the proliferation of hormone combination stage, adding proper amount of KT and obtain the best multiplication medium screening, established the Eucalyptus stem tip virus-free rapid propagation system, greatly promoted the proliferation and growth of adventitious buds proliferation, not only high efficiency, the proliferation time is short, and the seedling growth was robust, high uniformity, lay the foundation for the wide 29 Eucalyptus large-scale factory seedling afforestation regeneration and genetic transformation system.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及桉树的茎尖脱毒及快速增殖方法，尤其涉及巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，属于巨尾桉广林29的组培快繁领域。
技术介绍
桉树(Eucalyptus)又名尤加利树，是桃金娘科、桉属植物的总称，原产于澳大利亚，是澳大利亚木本植物中最具代表性的树种。桉树是世界著名的三大速生树种之一，具有适应性强、速生丰产、周期短等特点。桉树木材抗腐耐磨，林油兼备，广泛应用于建筑、造纸、精油、能源等行业，即可培育用材林、经济林等，也是荒山绿化及沿海防护林的优良树种。中国很早就引进了桉树树种，已经成为桉树种植的第二大国。巨尾桉广林29更以适应能力强，抗逆性强，速生质优丰产，出浆率高，干粗，通直等优点在中国南部地区广泛种植。广林29是以澳大利亚种源东门巨桉优树(Eucalyptusgrandis)作为母本、以印度尼西亚种源东门尾叶桉优树(Eucalyptusurophylla)为父本杂交而成的杂交种，具有父本母本的优良特性，一年生树可高达6m以上，单位面积生长量可达45m3/年*hm2，抗风性好，伐桩萌芽力强，一般一年即可郁闭成林；耐贫瘠，营养吸收能力强，具有较快经济和社会效益，是深受广西林农欢迎的桉树品种之一。桉树遗传性高度杂合，许多性状受多基因控制，传统的育种方法周期长，选育工作量繁重，采用扦插或压条等常规繁殖方法育苗成活率低，很难提供大量苗木，限制大面积推广造林。利用基因工程方法既可解决常规育种的不足，也可满足定向培育桉树新品种的要求。组培快繁是在保持品种特性的基础上，进行种苗的无性快速繁殖，是优良品种资源高效利用，桉树种植产业化、规模化的重要环节和关键技术。从20世纪60年代就已经开始对桉树进行组培技术研究，并获得了多个桉树品种的再生植株。在桉树组培脱毒离体快繁体系中，繁殖系数的大小，生长速率的快慢，快速增殖是关键的环节，继代增殖就成为了树种快速繁殖方法能否成功的关键环节。目前，桉树组培快繁的再生率低，多数情况下所用的植物生长调节剂的浓度和种类随着桉树品种的不同而不同。因此建立高效稳定的巨尾桉广林29离体快繁无菌苗体系和植株转化再生体系，对加速商品化大规模育苗造林，更好的利用基因工程手段选育出优质桉树新品种，提高其产量和质量以及对建立转基因再生系统等均具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是建立一种巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，该方法通过改良增殖培养阶段的激素组合，大大提高了芽苗的增殖效率，增殖时间短，且芽苗生长健壮，为巨尾桉广林29的大规模工厂化育苗及遗传转化再生系统的建立奠定基础。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，包括以下步骤，(1)将巨尾桉广林29的外植体消毒，接种到腋芽诱导培养基，诱导腋芽萌发；(2)将萌发的腋芽接种到增殖培养基，诱导丛生芽；(3)将丛生芽中的单个芽接种到生根培养基，诱导生根，获得完整再生植株；其中，所述增殖培养基为MS+6-BA0-2.0mg/L+NAA0-0.15mg/L+KT0-0.15mg/L+VC100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel3g/L；优选的，所述增殖培养基为MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.15mg/L+KT0.02-0.15mg/L+VC100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel3g/L；最优选的，所述增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.02mg/L+KT0.05mg/L+VC100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel3g/L。诱导丛生芽的条件为：光照16小时/天，光强2500-4000lx，温度为25-28℃，每20-30天继代一次。一般经过两次继代培养即可获得大量桉树无菌苗。目前关于桉树组培快繁的研究主要集中在赤桉、尾叶桉和邓恩桉，而对巨尾桉广林29的研究相对较少。本专利技术以中国广西广泛栽培的广林29桉树品种为受体材料，对增殖培养阶段增殖培养基的激素组合进行改良，筛选适宜的激素浓度配比。本专利技术首先考察了KT(激动素)对芽苗增殖的影响，结果表明在其他条件相同的培养条件下，在继代增殖培养基中添加适量KT对芽苗生长和增殖的综合效果较好，有效芽苗数多，比未添加KT的增殖培养基的苗数提高66.7％，增殖系数可达4.0以上，且芽苗健壮、整齐度高，生根率达95％；而未添加KT的增殖培养基上的芽苗则长势瘦弱，叶片发黄，有效芽苗数少，生根率低。为更好的确定增殖培养基中有效激素浓度，本专利技术进一步在基础MS培养基的基础上添加不同浓度梯度的6-BA、NAA和KT三种激素，观察丛生芽诱导情况。结果表明，KT激素用量在0.05～0.1mg/L范围内，随着KT激素使用量的增加，对增殖效率有较理想的促进作用。其中，MS+KT0.05mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L组合的增殖系数最高，达到5.03，比其他激素组合培养基的增殖系数高19.2个百分点以上；增殖效率快，达到最高增殖系数的平均时间仅28天，增殖时间比其他激素组合培养基缩短10天以上；而且芽苗生长状态良好，有效芽苗数多，芽苗茎节长，平均芽长比其他处理长38％以上。因此，本专利技术确定培养基MS+KT0.05mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.02mg/L+蔗糖30g/L+VC100mg/L+Phytagel3g/L，pH5.8-6.0为广29桉树最佳的芽增殖培养基。另外，在继代增殖培养过程中不可过早切取萌生芽，不利于芽增殖丛生分化；若待芽开始有些半木质化，过晚转移继代萌生芽，芽增殖效率明显降低，也不利于丛生芽分化。本专利技术所述巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法中，所述腋芽诱导培养基为MS+6-BA0-2.0mg/L+NAA0-0.5mg/L+VC100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel3g/L；优选的，所述腋芽诱导培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+VC100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel3g/L。培养基中添加适量的VC可有效的遏制培养材料褐化及死亡。本专利技术所述生根培养基为1/2MS+NAA0-0.1mg/L+IBA0.2-0.5mg/L，还含有蔗糖30g/L+Phytagel3g/L。本专利技术所述的巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法中，所述增殖培养基、腋芽诱导培养基或生根培养基的pH均为5.8-6.0。本专利技术所述外植体为巨尾桉广林29当年扦插枝条的中上部半木质化的茎段；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，包括以下步骤，(1)将巨尾桉广林29的外植体消毒，接种到腋芽诱导培养基，诱导腋芽萌发；(2)将萌发的腋芽接种到增殖培养基，诱导丛生芽；(3)将丛生芽中的单个芽接种到生根培养基，诱导生根，获得完整再生植株；其特征在于：所述增殖培养基为MS+6‑BA 0‑2.0mg/L+NAA 0‑0.15mg/L+KT 0‑0.15mg/L+VC 100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L。

【技术特征摘要】
1.一种巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，包括以下步骤，(1)将巨尾桉广林29的
外植体消毒，接种到腋芽诱导培养基，诱导腋芽萌发；(2)将萌发的腋芽接种到增殖培养基，
诱导丛生芽；(3)将丛生芽中的单个芽接种到生根培养基，诱导生根，获得完整再生植株；其
特征在于：所述增殖培养基为MS+6-BA0-2.0mg/L+NAA0-0.15mg/L+KT0-0.15mg/L+VC100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel3g/L。
2.按照权利要求1所述的巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，其特征在于：所述增
殖培养基为MS+6-BA0.5-2.0mg/L+NAA0.02-0.15mg/L+KT0.02-0.15mg/L+VC100mg/L+
蔗糖30g/L+Phytagel3g/L。
3.按照权利要求2所述的巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，其特征在于：所述增
殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.02mg/L+KT0.05mg/L+VC100mg/L+蔗糖30g/L+
Phytagel3g/L。
4.按照权利要求1所述的巨尾桉广林29茎尖脱毒及快速增殖方法，其特征在于：所述腋
芽诱导培养基为MS+6-BA0-2.0mg/L+NAA0-0.5mg/L+VC100mg/L+蔗糖30g/L+Phytagel
3g/L。
5....

【专利技术属性】
技术研发人员：程红梅，陆国清，郭惠明，郭泽旺，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，广西田园生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11