细胞穿透缀合物及其使用方法技术

本文中提供了细胞穿透缀合物。所述缀合物包含附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。还提供了包含所述缀合物的组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年8月29日提交的美国临时申请第61/871,729号以及2014年2月14日提交的美国临时申请第61/939,993号的优先权，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。关于在联邦资助的研究和开发下进行的本专利技术的权利的声明本专利技术是使用在由美国国家卫生研究院颁发的第CA122976号基金下的资助进行的。政府具有本专利技术的某些权利。专利技术背景抗体因其相对于其它类型的药物诸如小分子药物的容易产生、特异性和生物耐久性而已经被证明是有效的药物形式。目前的抗体疗法只能靶向细胞外分子。然而，对于疾病治疗和疾病诊断的许多重要靶是细胞内的。例如，许多转录因子，诸如STAT3，是用于癌症治疗的最重要的然而具有挑战性的靶之一。本文中提供了用于本领域中的这些和其它需求的解决方案。专利技术简述需要使用肽和蛋白(例如抗体)来靶向细胞内的分子。然而，肽和蛋白质(例如抗体)以有效方式靶向细胞内分子的能力已证明是困难的。如在下面的实例中详尽描述的和证明的，除其它以外，本文中提供了修饰肽和蛋白质(例如抗体)，以使它们具有细胞穿透性，从而使它们能够甚至通过全身性施用有效地靶向细胞内分子的方法。另外，已显示，复合物中的两种不同的蛋白质可被提供的经修饰的抗体靶向。所提供的细胞穿透肽(蛋白质)技术可被广泛地用于靶向各种细胞内蛋白质(例如，致癌蛋白、细胞内驻留的病毒蛋白质>等)。除其它外，本文还提供了细胞穿透缀合物。在一个方面，所述缀合物包括附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送。在其它方面，提供了组合物和包含所述缀合物的试剂盒。在另一个方面中，提供了将非细胞穿透蛋白递送入细胞的方法。所述方法包括将细胞与细胞穿透缀合物(包括附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白)接触，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送。在另一个方面，提供了治疗受试者的疾病的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的细胞穿透缀合物(包括附接于硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链的非细胞穿透蛋白)，其中所述硫代磷酸酯核酸或硫代磷酸酯聚合物主链增强了非细胞穿透蛋白的细胞内递送，并且其中所述缀合物的施用治疗受试者的疾病。附图简述图1A、1B、1C、1D和1E显示利用抗体靶向STAT3融合蛋白或STAT3/输出蛋白7复合物的两个分立部分将STAT3保留在细胞质中。图1A是显示通过针对STAT3-GFP的STAT3和GFP抗体至小鼠3T3/v-Src细胞的递送将STAT3-GFP限制在细胞质中的图像。添加Hoechst33342以对核酸进行染色。比例尺为10μm。图1B是肿瘤裂解物的STAT3或输出蛋白7免疫沉淀后的免疫印迹分析的图像，显示了STAT3与输出蛋白7相互作用。PIS：免疫前血清。图1C是使用(Uppsala,Sweden)技术进行的U251细胞中的相互作用的STAT3和输出蛋白7的原位位定的图像。相互作用事件显示为点样结构。将阻止检测抗体对STAT3识别的STAT3阻断肽用作对照。在右下角放大显示选定的区域(虚线)。比例尺为10μm(左图)。图1D是STAT3与输出蛋白7相互作用的定量分析的图表，n＝4(总信号，左)；细胞核对比细胞质信号事件，n＝26(右)。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图1E是显示STAT3和输出蛋白7抗体的细胞内递送将STAT3捕获在细胞质中的图像。活细胞共焦成像表明对双抗体法对STAT3细胞再分布的作用。比例尺为10μm。图2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G表明STAT3的赖氨酸乙酰化决定STAT3核质穿梭和输出蛋白7的亚细胞定位。图2A是显示赖氨酸685对于STAT3核质穿梭是至关重要的iFLAP活细胞共焦成像的图像。通过多轮细胞质YFP漂白将与CFP和YFP融合的STAT3或STAT3K685R的细胞内移动作为时间的函数进行跟踪。比例尺10μm。图2B是显示STAT3K685R经历核保留并且未被STAT3和GFP抗体保留在细胞质中的图像。比例尺10μm。图2C是显示STAT3赖氨酸乙酰化而非酪氨酸磷酸化对于与输出蛋白7的相互作用是至关重要的免疫印迹的图像。图2D是显示突变具有组成型活性的STAT3中的K685消除STAT3与输出蛋白7之间的相互作用的图像。STAT3和STAT3K685R在U251人细胞中过表达，并且从全细胞裂物进行共沉淀实验。图2E是显示突变K685在体内减小STAT3与输出蛋白7、出核转运检查点核孔蛋白50和核孔蛋白153的相互作用的图像。显示的是在从通过在无胸腺裸鼠中植入利用STAT3wt-YFP或STAT3K685R-YFP重建的STAT3缺陷MEF细胞生长的肿瘤制备的裂解物的免疫沉淀后的免疫印迹分析。图2F是显示乙酰化不足的STAT3K685R在体内限制输出蛋白7的细胞核输出的图像。显示的是共聚焦显微照片。用Hoechst33342对核酸进行染色。比例尺为50μm。图2G是显示STAT3wt和STAT3K685R肿瘤中的细胞核输出蛋白7的定量的图，n＝6(左图)和细胞核直径，n＝6(右图)。***，P<0.001；**，P<0.01。图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H和3I显示在体内靶向STAT3和体内输出蛋白7复合物对于癌症治疗是有效的。图3A是显示当用指定的抗体治疗时C57BL/6小鼠中的小鼠B16黑素瘤的肿瘤生长动力学的图表。每一个点代表治疗。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图3B是如通过肿瘤的STAT3和核孔蛋白50或153的免疫共沉淀后的免疫印迹分析所显示的，在肿瘤中中断STAT3穿梭的双抗体治疗的图像。图3C是显示双抗体治疗在体内对肿瘤、肿瘤脉管血管和增殖活性的效果的苏木精和伊红(H&E)染色的图像和共聚焦图像。比例尺为100μm。图3D是显示CD31+肿瘤血管(n＝4)和Ki67+增殖活性(n＝3)的定量的柱状图柱形图。学生T检验***，P<0.001；**，P<0.01；*P<0.05。图3E是显示STAT3靶基因，Bcl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含附接于硫代磷酸酯核酸的非细胞穿透蛋白的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞内递送。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.29 US 61/871,729;2014.02.14 US 61/939,9931.一种包含附接于硫代磷酸酯核酸的非细胞穿透蛋白的细胞穿
透缀合物，其中所述硫代磷酸酯核酸增强所述非细胞穿透蛋白的细胞
内递送。
2.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸
酯核酸共价地附接于所述非细胞穿透蛋白。
3.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷酸
酯核酸非共价地附接于所述非细胞穿透蛋白。
4.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，其中多个硫代磷酸
酯核酸附接于所述非细胞穿透蛋白。
5.根据权利要求4所述的细胞穿透缀合物，其中所述多个硫代
磷酸酯核酸的每一个共价地附接于所述蛋白。
6.根据权利要求4所述的细胞穿透缀合物，其中所述多个硫代
磷酸酯核酸的每一个非共价地附接于所述蛋白。
7.根据权利要求4所述的细胞穿透缀合物，其中所述蛋白包含
共价和非共价地附接的硫代磷酸酯核酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中
每一个硫代磷酸酯核酸独立地附接于所述非细胞穿透蛋白的赖氨酸、
精氨酸、半胱氨酸或组氨酸。
9.根据权利要求8所述的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代磷
酸酯核酸附接于所述蛋白的半胱氨酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞穿透缀合物，其中
每一个硫代磷酸酯核酸的长度独立地为10、20、30、40、50、60、

\t70、80、90、100个或更多个核酸残基。
11.根据权利要求10所述的细胞穿透缀合物，其中每一个硫代
磷酸酯核酸的长度独立地为10至30个残基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的细胞穿透缀合物，其
中所述非细胞穿透蛋白具有大于25kD的分子量。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的细胞穿透缀合物，其
中所述非细胞穿透蛋白具有25至750kD的分子量。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞穿透缀合物，其
中所述非细胞穿透蛋白为抗体。
15.根据权利要求14所述的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为
IgG抗体。
16.根据权利要求14所述的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为
IgA、IgM、IgD或IgE抗体。
17.根据权利要求14所述的细胞穿透缀合物，其中所述抗体为
Fv片段。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的细胞穿透缀合物，其
中所述抗体为人源化抗体。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的细胞穿透缀合物，其
中所述非细胞穿透蛋白结合细胞内靶。
20.根据权利要求19所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内
靶是选自由以下组成的组的疾病的靶：自身免疫性疾病、炎性疾病、
代谢障碍、发育障碍、心血管疾病、肝病、肠道疾病、感染性疾病、
内分泌疾病、神经障碍和癌症。
21.根据权利要求19或20所述的细胞穿透缀合物，其中所述细
胞内靶为信号转导分子或转录因子。
22.根据权利要求21所述的细胞穿透缀合物，其中所述信号转
导分子为磷酸酶或激酶。
23.根据权利要求20所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内
靶为癌症靶。
24.根据权利要求19所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内
靶选自由STAT3、输出蛋白7、Her2和Src组成的组。
25.根据权利要求19所述的细胞穿透缀合物，其中所述细胞内
靶为磷酸化Src。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的细胞穿透缀合物，其
中所述非细胞穿透蛋白还包含附接于所述蛋白的标记物、小分子或功
能性核酸。
27.一种结合于细胞内靶的权利要求1至26的任一项的细胞穿
透缀合物。
28.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，所述细胞穿透缀合
物是通过将未附接的非细胞穿透蛋白与未附接的硫代磷酸酯核酸接
触和使所述未附接的硫代磷酸酯核酸共价地结合于所述未附接的非
细胞穿透蛋白的氨基酸，从而附接和形成所述细胞穿透缀合物制成
的。
29.根据权利要求28所述的细胞穿透缀合物，其中所述硫代磷
酸酯核酸包含共价反应性部分。
30.根据权利要求29所述的细胞穿透缀合物，其中所述共价反
应性部分与所述蛋白的赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸或组氨酸具有反应

\t性。
31.根据权利要求29所述的细胞穿透缀合物，其中所述共价反
应性部分与半胱氨酸具有反应性。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的细胞穿透缀合物，其
中所述共价反应性部分为乙烯砜。
33.根据权利要求1所述的细胞穿透缀合物，所述细胞穿透缀合
物是通过将未附接的非细胞穿透蛋白与未附接的硫代磷酸酯核酸接
触和使所述未附接的硫代磷酸酯核酸结合于所述未附接的非细胞穿
透蛋白，从而附接和形成所述细胞穿透缀合物制成的，其中所述未附
接的硫代磷酸酯核酸包含具有式–S-S-(CH2)z-OH的取代基，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·李，J·E·夏夫利，P·M·希维德尔斯基，A·赫尔曼，H·于，
申请(专利权)人：希望之城，
类型：发明
国别省市：美国;US