本发明专利技术涉及一种透明质酸钠巯基衍生物的制备方法，该方法为透明质酸钠通过偶联试剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)的活化作用，与胱胺发生交联反应，然后再经二硫苏糖醇还原得到透明质酸钠巯基衍生物。该透明质酸钠巯基衍生物在氧化环境下，可以形成二硫键，起到消除氧化剂和清除自由基的作用，经氧化形成的二硫键在体内较强还原条件下又能可逆的重新断开，得到巯基衍生物，因而起到维持体内氧化-还原环境平衡的作用，为注射美容、系统性疾病的早期预防以及智能药物缓释提供一种新的选择手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及智能医用生物材料
，是一种涉及一种透明质酸钠衍生物的制备方法，该透明质酸衍生物用于抗衰老、药物缓释、关节腔注射、注射美容等方面。
技术介绍
自由基学说（Freeradicaltheory）是具有代表性的致衰学说之一。这一学说在20世纪50年代中期由著名学者HaMan首先提出，其后得到许多学者的共识。自由基是指独立存在的，含有1个或1个以上的不配对电子的任何原子或原子团，是机体正常代谢的中间产物，在机体内具有很强的氧化反应能力，且易产生连锁反应，对蛋白质、核酸、脂质等产生伤害，从而导致机体的损伤。大量的科学实验证实，氧自由基与机体损伤有着非常密切的关系。氧自由基是需氧生物细胞进行正常代谢的副产品。据统计机体每天吸入的氧气中有1%产生氧自由基。实验证明机体细胞存在少量氧自由基是维持生命所必需的，如甲状腺素的合成，必须有少量氧自由基的参与；嗜中性白细胞释放出的超氧阴离子及巨噬细胞产生的NO对杀灭外源细菌及体内坏死组织具有重要的意义。但氧自由基产生过多，或机体内的抗氧化自由基系统被大量消耗，氧自由基与抗氧自由基平衡失调时，自由基才便会引起疾病。大量的文献报道现有的诸多系统性疾病如风湿性骨关节炎、糖尿病、骨质疏松、白内障等均与氧自由基过多有密切的关系。巯基化合物是一种具有较强还原性的活性化合物，在较低的氧化环境下即可发生反应，巯基自身氧化成二硫键化合物；而形成的二硫键在还原环境下，又可逆形成巯基。现在较常见的巯基化合物有半胱氨酸、谷胱甘肽（还原型）等。但是这类化合物均为小分子化合物，在体内易代谢，残存时间短。如何延长体内残存时间，更好地发挥巯基的抗氧化能力，是这类化合物用于抗氧化应用的关键。透明质酸钠巯基化衍生物主要通过高分子与巯基乙酸、巯基乙醇、谷胱甘肽等含巯基基团的化合物之间发生接枝或交联反应制备而成。最常用的方法为碳二亚胺（EDC）活化羧基，进而接入巯基基团，但该方法接枝率低，对反应体系的PH依赖性高不利于产业化生产，同时由于巯基化合物花絮性质非常活泼，反应过程中极易引起巯基化合物的氧化，进而导致接枝率低；为改善上述弊端，大量的文献报道采用含二硫键的化合物进行接枝反应，然后通过二硫苏糖醇（DTT）将二硫键打断形成含有游离巯基的透明质酸衍生物，该方法解决了在接枝反应体系中巯基化合物易于氧化的弊端，但该方法首先需要在二硫键化合物的基础进行酰肼改性引入氨基，然后通过氨基与透明质酸中羧基之间的酰胺化反应形成目的产物，由此可见该种方法工艺繁琐，同时引入诸多的有机溶剂不利于后续的规模化放大及其生物相容性。鉴于上述方法的不足，本专利技术采用吗啉衍生物作为偶联试剂进行制备透明质酸衍生物凝胶（以下简称DMTMM法）。DMTMM是目前较为理想的生成酰胺键的方法之一，其具有如下几个优势：1.反应活性高，单一氨基酸的接枝率可达到70%以上；2.反应温和，低温和室温下即可反应；3.对PH的依赖性弱，易于产业化生产；4.副反应少，未参加反应的吗啉衍生物不与透明质酸钠反应，且易于去除，有利于产品的质量控制。
技术实现思路
本专利技术涉及了一种巯基化透明质酸衍生物的制备，得到的透明质酸巯基衍生物，可以对体内的氧化剂或自由基起到响应，起到抗衰老、抗氧化作用。专利技术的具体内容如下：本专利技术采用现在较为常用的偶联试剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)，该偶联试剂具有反应活性高、低毒、易于去除等优点，主要用于活化羧基，进行酰胺键的合成制备。胱胺为有机二硫化合物，其分子的两端为氨基，均可以与羧酸形成酰胺键。在偶联试剂DMTMM的作用下，胱胺与透明质酸钠的羧基端进行偶联反应，得到透明质酸钠衍生物，再通过二硫苏糖醇（DTT）还原，得到透明质酸的巯基衍生物。该衍生物在氧化剂存在下，有效地消除氧化剂，自身形成较好强度的水凝胶。说明书附图图1灭菌前后透明质酸钠衍生物巯基含量。图2透明质酸钠衍生物对于自由基的消除作用。图3透明质酸钠衍生物对于谷胱甘肽的感应曲线。具体实施方式现结合实施例，对本专利技术作详细描述，但本专利技术的实施不仅限于此。实施例一将胱胺二盐酸盐0.2817g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为4，称取1g透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4℃过夜。第二天称取DMTMM0.6918g用5mL水完全溶解并用盐酸将pH值调为4，然后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4℃下反应2天。将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每1h更换透析液1次并称重，直到凝胶质量不在增加时，终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，用1M的NaOH水溶液调节凝胶pH值为8~10，混合均匀后，加入二硫苏糖醇1.928g，室温下过夜反应，得到的反应液用盐酸溶液调节pH到3左右后，将溶液转移到透析袋中（截留分子量40000），用1mM的盐酸和0.3M的氯化钠溶液透析2天，最后用1mM的盐酸透析1天。收集透析好的溶液并冷冻干燥，待用。实施例二将胱胺二盐酸盐0.2817g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为6，称取1g透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4℃过夜。第二天称取DMTMM0.6918g用5mL水完全溶解并用盐酸将pH值调为6，然后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4℃下反应2天。将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每1h更换透析液1次并称重，直到凝胶质量不在增加时，终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，用1M的NaOH水溶液调节凝胶pH值为8~10，混合均匀后，加入二硫苏糖醇1.928g，室温下过夜反应，得到的反应液用盐酸溶液调节pH到3左右后，将溶液转移到透析袋中（截留分子量40000），用1mM的盐酸和0.3M的氯化钠溶液透析2天，然后用1mM的盐酸透析1天。收集透析好的溶液并冷冻干燥，待用。实施例三将胱胺二盐酸盐0.2817g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为6.5，称取1g透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4℃过夜。第二天称取DMTMM0.6918g用5mL水完全溶解并用盐酸将pH值调为6.5，然后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4℃下反应2天。将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每1h更换透析液1次并称重，直到凝胶质量不在增加时，终止透析，将该凝胶粉碎制粒后，用1M的NaOH水溶液调节凝胶pH值为8~10，混合均匀后，加入二硫苏糖醇1.928g，室温下过夜反应，得到的反应液用盐酸溶液调节pH到3左右后，将溶液转移到透析袋中（截留分子量40000），用1mM的盐酸和0.3M的氯化钠溶液透析2天，然后用1mM的盐酸透析1天。收集透析好的溶液并冷冻干燥，待用。实施例四将胱胺二盐酸盐0.2817g溶解于15mL水中，用盐酸调节pH为7，称取1g透明质酸钠干粉，搅拌均匀后，放4℃过夜。第二天称取DMTMM0.6918g用5mL水完全溶解并用盐酸将pH值调为7，然后加入凝胶中，待完全搅拌均匀后，4℃下反应2天。将反应好的凝胶切成块后，用PBS缓冲液透析，每1h更换透析液1次并称重，直到凝胶质量不在增加时，终止透析，将该凝胶粉本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种透明质酸巯基衍生物的制备方法，其主要特征为使用透明质酸钠为原料，胱胺为修饰试剂，采用4‑(4,6‑二甲氧基三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)为偶联试剂，制备透明质酸钠衍生物，该衍生物经二硫苏糖醇还原后，得到透明质酸钠巯基衍生物。
【技术特征摘要】
1.一种透明质酸巯基衍生物的制备方法，其主要特征为使用透明质酸钠为原料，胱胺为修饰试剂，采用4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)为偶联试剂，制备透明质酸钠衍生物，该衍生物经二硫苏糖醇还原后，得到透明质酸钠巯基衍生物。
2.如权利要求1所述，使用的修饰试剂为胱胺或胱胺盐酸盐，与透明质酸钠的比例为1/10～2/1（mol/mol）。
3.如权利要求1所述，用于反应的溶液体系的pH为3~9。
4.如权利要求1所述，使用的透...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏长征，宋瑞瑞，奚宏伟，蒋丽霞，
申请(专利权)人：上海其胜生物制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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