一种检测牛奶中头孢喹肟残留量的方法技术

本发明专利技术涉及一种以超高效液相色谱‑电喷雾串联质谱检测牛奶中头孢喹肟残留量的方法，为牛奶中头孢喹肟药物残留监控工作提供了技术手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物残留检测领域，特别是一种定性和定量检测牛奶中头孢喹肟残留量的方法。
技术介绍
头孢菌素类抗生素主要用于治疗革兰氏菌引起的各种感染，具有抗菌谱广、疗效高、毒性低、过敏反应少等优点，但过量的抗生素又具有毒副作用，主要体现在对脑神经、听觉以及肾脏的损害。我国已对头孢菌素类药物在牛肉、猪肉和牛奶等制品中的限量均进行了规定。头孢喹肟是第一个动物专用的第4代头孢菌素类抗生素，通过抑制细胞壁的合成达到杀菌效果，具有广谱抗菌性，抗菌活性强，可以在乳腺组织达到较高的浓度。头孢喹肟目前已在我国注册准许兽用，临床主要用于治疗大肠杆菌引起的奶牛乳房炎，多杀性巴氏杆菌或胸膜肺炎放线杆菌引起的猪呼吸道疾病。目前国内针对头孢喹肟的检测标准和方法主要有高效液相色谱法和超高效液相色谱-串联质谱法，多集中在畜禽产品上。关于牛奶中头孢喹肟大多数文献采用高效液相色谱法，高效液相色谱法只能通过保留时间定性，准确性较差且灵敏度低。本专利技术建立了牛奶中头孢喹肟残留的超高效液相色谱-电喷雾串联质谱仪测定方法，该方法前处理简便易操作、准确性好、灵敏度高。超高效液相色谱(UltraPerformanceLiquidChromatography\\UPLC)是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。三重四极杆串联质谱工作原理：化合物分子在真空条件下受电子流的“轰击”或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带正电荷的离子，这些离子按质荷比(m/z)的大小被收集并记录的图谱。电喷雾电离(ESI)：样品溶液在电场的作用下形成带高度电荷的雾状小液滴，在向质量分析器移动的过程中，液滴因溶剂不断挥发而缩小，导致表面电荷密度不断增大，当电荷之间的排斥力足以克服液滴的表面张力时，液滴发生裂分，如此反复进行，最后得到带单电荷或多电荷的离子。三重四极杆串联质谱优点：(1)不需进行衍生化。(2)在单个分析中实现确认定量。(3)在复杂很脏的基体中的低检测限。(4)更可靠和可值得信赖的测试结果。(5)质量范围：5-1200amu(6)灵敏度高、定量重现性好
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种简便、快速、灵敏、准确且经济的检测牛奶中头孢喹肟残留量的方法。本专利技术包括下列步骤：本专利技术以超高效液相色谱-电喷雾串联质谱作为检测的基本原理，现代超高效液相色谱-电喷雾串联质谱系统配置有化学工作站、计算机和软件系统在内的数据采集与处理系统，可准确检测牛奶中头孢喹肟的残留量。超高效液相色谱-电喷雾串联质谱分为两个步骤：数据采集与数据处理。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。标准溶液的配置：标准储备液：称取适量头孢喹肟标准品，用甲醇分别配制成1.0mg/mL的标准储备液，于-18℃下避光储存。标准中间液：取上述标准储备液各1mL，用甲醇分别稀释成质量浓度为10.0mg/L的标准中间液，于-18℃下避光储存。标准混合工作液：取上述标准中间液各1mL，用甲醇稀释成质量浓度为1.0mg/L的标准混合工作液，于-4℃下避光储存。此法根据选择离子定性和定量。取空白牛奶样品，添加不同质量浓度的头孢喹肟标准溶液，按照优化实验条件由高至低的质量浓度进行检测，直至信噪比等于3(S/N＝3)和信噪比等于10(S/N＝10)时，确定猪毛和鸡毛样品中头孢喹肟的检出限(LOD)为1.0μg/L，定量限(LOQ)为3.0μg/L。标准工作曲线配制头孢喹肟标准溶液质量浓度为2.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg/L的系列标准溶液，以定量离子峰面积(y)对浓度(x，μg/L)做标准曲线。结果显示，头孢喹肟在2～20.0μg/L范围内的线性关系良好(r2＞0.999)。牛奶中头孢喹肟线性回归方程及相关系数见表1。表1牛奶中头孢喹肟线性回归方程及相关系数准确度和精密度：取空白牛奶样品，添加头孢喹肟标准溶液分别为2.0、5.0、10.0μg/L，然后按照本方法进行样品前处理和测定，每个添加水平测定6次，日内精密度通过1d内测定3个加标水平下的6个平行样品得到，日间精密度为连续6d(每天测定1次)测定3个加标水平下的样品得到，结果显示，头孢喹肟添加浓度为2.0、5.0、10.0μg/L时，方法的平均回收率为89.2％～102.5％，日内相对标准偏差为1.88％～4.24％，日间相对标准偏差为3.69％～6.85％。准确度、精密度和相对标准偏差见表2。表2空白牛奶中添加头孢喹肟日内和日间精密度及相对标准偏差(n＝6)试样中头孢喹肟残留量以质量分数X计，数值以微克每升(μg/L)表示，单点校正按式(1)、(2)计算：式中：Ci—试样溶液中头孢喹肟浓度(μg/L)；Cs—对照溶液中头孢喹肟浓度(μg/L)；Ai—试样溶液中头孢喹肟峰面积；As—对照溶液中头孢喹肟峰面积；X—试样中头孢喹肟的残留量(μg/kg)；V1—样液最终定容体积(mL)；V—试样量(g)；标准曲线校准按式(3)计算：Ci—标准曲线上查得的试样中头孢喹肟浓度(μg/L)；；V1—样液最终定容体积(mL)；V—试样量(g)。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的20％。质谱条件的优化：分别配制1.0mg/L的头孢喹肟标准溶液，不通过色谱柱直接进入离子源，在ESI+模式下分别进行质谱条件的优化。先进行一级质谱图全扫描，确定各目标化合物的母离子，并优化得到源内碎裂电压，然后在选定的源内碎裂电压条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，选取丰度相对最强的1对碎片离子作为定量离子，次强的1对或2对碎片离子作为定性离子，并分别对子离子的碰撞能进行优化。最后在MRM模式下分别对雾化气压力、干燥气温度和流量等参数进行优化。优化后的质谱条件见表3。表3MRM监测模式下金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉胍及D15-金刚烷胺的质谱优化条件*定量离子为进一步说明本专利技术的特点和效果，以下结合附图对专利技术做进一步的描述。附图说明图1：冻干牛奶样品中添加2.0μg/L头孢喹肟TIC图实施例下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。应该理解的是，本专利技术实施例所述方法仅仅是用于说明本专利技术，而不是对本专利技术的限制，在本专利技术的构思前提下对本专利技术制备方法的简单改进都属于本专利技术要求保护的范围。准确量取牛奶2.00mL试样于50mL聚丙烯离心管中,加入2mL水,再加入10mL1％乙酸乙腈，超声提取3min，4℃条件下4500r/min离心10min，将上清液转移至100mL鸡心瓶中，残渣用10mL乙腈溶液重复提取一次，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测牛奶中头孢喹肟残留量的方法，其特征在于包括以下步骤：1、准确量取牛奶2.00mL试样于50mL聚丙烯离心管中,加入2mL水,再加入10mL 1％乙酸乙腈，超声提取3min，4℃条件下4500r/min离心10min，将上清液转移至100mL鸡心瓶中，残渣用10mL乙腈溶液重复提取一次，合并两次提取液。将提取液于40℃水浴中减压浓缩至近干，加入5mL水溶解后上机。2、液相条件：流动相：A:0.1％甲酸水,B:乙腈，梯度洗脱：O‑2min保持8％B,2‑4min 8％B线性变化至70％B，4‑8min保持70％B，8‑8.5min 70％B线性变化至8％B，8.5‑12min保持8％B。流速：0.3mL/min进样量：5.00μL。

【技术特征摘要】
1.一种检测牛奶中头孢喹肟残留量的方法，其特征在于包括以下步骤：1、准确量取牛奶2.00mL试样于50mL聚丙烯离心管中,加入2mL水,再加入10mL1％乙酸乙腈，超声提取3min，4℃条件下4500r/min离心10min，将上清液转移至100mL鸡心瓶中，残渣用10mL乙腈溶液重复提取一次，合并两次提取液。将提取液...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡丽芳，周瑶敏，徐俊，聂根新，张金艳，
申请(专利权)人：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，
类型：发明
国别省市：江西;36