本发明专利技术属于植物遗传标记制备与应用技术领域。具体涉及一种遗传标记在紫杏鉴定中的应用，本发明专利技术利用DNA条形码基因序列，建立PCR扩增方法和采用0.5％的琼脂糖凝胶电泳图谱直接检测紫杏(P.dasycarpa Ehrh.)的特征条带，若在一个泳道上同时出现2条分子量大小约750bp和720bp片段则能够判断是紫杏，若仅仅有一条720bp的片段判定为普通栽培杏。本发明专利技术可快速、精准地对紫杏和其他栽培杏进行分子鉴定，本发明专利技术简化了鉴定程序，降低了鉴定成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物物种分子鉴定
具体涉及一种遗传标记在紫杏(P.dasycarpaEhrh.)鉴定中的应用，其包括DNA条形码基因序列PCR扩增和用0.5％琼脂糖凝胶电泳检直接进行检测紫杏的特征条带，可快速、简单、精准的对紫杏进行分子鉴定。本专利技术可以实现经济、快速且高效的鉴别物种，有效的鉴定物种，提高苗木纯度，降低鉴定成本。通过对ITS序列PCR扩增，直接通过电泳图谱进行研判特征片段的大小和数量，若在一个泳道上同时出现2条分子量大小约750bp和720bp片段则能够判断是紫杏，若仅仅有一条720bp的片段判定为普通栽培杏。
技术介绍
新疆南部是我国栽培杏重要的原生起源地之一，有着悠久的栽培历史和丰富的遗传多样性。新疆有紫杏(P.dasycarpaEhrh.)和普通杏(P.armeniacavulgarisL.)两个种，而紫杏(P.dasycarpaEhrh.)仅在新疆有所分布，其种下变异类型丰富，现有的鉴定方法主要是对仅仅依靠叶形、果形、果色、果实表皮和花器官等形态指标鉴定紫杏，这种鉴定的方法易受环境和植物生长季节的影响，耗时长，同时还不能对紫杏进行早期快速筛选。新疆的杏(亚)属植物资源变异丰富，而对各种果树植物分类和不同的物种进行鉴定，这利于物种遗传多样性、系统发育学和遗传改良的研究以及野生资源的开发与利用。DNA条形码是近年兴起的应用短的、标准化的DNA序列鉴定物种的新技术。自2003年PaulHebert提出这一概念以来(Hebertetal.，2003)，多个片段或片段组合被提出可作为植物类群分类的候选片段。Sass等，2007年，对裸子植物门苏铁目的研究表明，尽管ITS测序存在一定困难，但凭其较高的变异特点，仍然是7个DNA片段(matK、ndhJ、rpoC1、accD、ycf5、psbA-trnH、ITS)中最有潜力的条形码。众所周知，ITS序列相对比较保守，Lee等2001年就对该序列在李属植物中的系统发育进行了研究(Leeetal.,2001)。目前，许多分子标记技术已在杏的遗传多样性和种质鉴定的研究中应用。例如Yuan等2007年利用荧光AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)标记研究了新疆喀什、和田和库车三个地区的86份杏品种(系)的遗传多样性；He等2007年利用SSR(simplesequencerepeat)标记对新疆喀什、和田和库车地区的22份杏种质遗传多样性研究；Liu等2016年利用ISSR(Inter-SimpleSequencerepeats)标记分析部分南疆杏品种(系)的遗传多样性，Williams等1990年利用RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)标记研究了野生山杏、中国北方栽培杏资源的亲缘关系和种质鉴定。这些结果均表明我国新疆主栽杏品种(系)的遗传多样性较丰富。近来，如Zhang等2014年利用SSR标记研究我国栽培杏的遗传多样性，也表明我国南疆杏的遗传多样性最为丰富；Li等2014年利用ISSR和SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism)标记研究我国北方栽培杏的遗传多样性和亲缘关系，发现我国南疆杏的遗传多样性最为丰富。但这些标记均为匿名标记，迄今，还没有提供鉴定紫杏的相关分子标记。因此本申请人对现有的杏属材料进行ITS序列扩增，并结合公共数据库平台NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，通过测序结果进行生物信息学分析，发现所有紫杏材料中都有一条长序列(登陆号KX890450，登陆号KX890452，约750bp)和一短(登陆号KX890451，KX890449；720bp)两条ITS序列，即发现一条长序列为特异性序列，因此直接利用0.5％的琼脂糖凝胶电泳的分子筛的作用，就可以对紫杏进行区分和鉴定，可有效节约鉴定时间和经费。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种紫杏早期快速分子鉴定方法，本专利技术的技术方案主要特征是将DNA条形码基因序列PCR扩增技术和物种鉴定有机结合，从而能够快速、简单、精准的对紫杏进行分子鉴定。本方法通过对ITS序列PCR扩增后，直接利用0.5％琼脂糖凝胶电泳检检测，通过判断紫杏的特征条带的大小和有无来鉴定物种，若在一个泳道上同时出现2条分子量大小约750bp和720bp片段就能够判断为紫杏，若仅仅有一条720bp的片段判定为普通栽培杏。本专利技术可以实现经济、快速且高效的鉴别物种，有效的鉴定紫杏，提高苗木纯度，降低鉴定成本。这种方法比直接测序或者克隆测序方法降低了鉴定成本，节约了时间。本专利技术的技术方案如下所述：一种紫杏(P.dasycarpaEhrh.)的分子鉴定方法，所述的方法包括下列步骤：(1)从待测杏材料中提取基因组DNA；(2)以登陆号为KX890450与登陆号KX890452和登陆号为KX890451与KX890449两条ITS序列为模板设计引物，进行PCR扩增：所述的引物的序列如下所述：ITS-55’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，ITS-45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；(2)反应体系如下：50μL体系中含有1×Buffer，1.5mmol/LMg2+，0.20mmol/LdNTPs，引物ITS-5和ITS-4各0.20mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，0.1mg/mLBSA，4％DMSO，30-50ng模板DNA；(3)扩增程序如下96℃预变性5min，96℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸至1min，循环30次，最后72℃延伸至7min；(4)对所得的PCR产物用0.5％琼脂糖电泳进行检测；其步骤如下：1)待凝胶完全凝固，小心拔去梳子；2)将电泳样品依次加入点样孔中；3)将制胶板放入电泳槽中(电泳缓冲液淹过凝胶约1mm为宜)，打开电泳仪，使核酸样品由负极向正极泳动，电泳时间为35min；4)电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入凝胶成像系统中观察电泳结果，并照相记录。对跑胶带进行研判，若在一个泳道上同时出现2条分子量大小约750bp和720bp的片段确定为紫杏，若仅仅有一条720bp的片段判定为普通栽培杏。申请人提供了一种适用于紫杏分子鉴定的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。(这个分子标记的登陆号为KX890450与登陆号为KX890452)。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术提供了一种利用紫杏ITS序列的特殊性，与现有鉴定紫杏(P.dasycarpaEhrh.)的形态观察方法相比，不需测序，不需要受到鉴定时期(开花期，结果期，果实成熟期的限制)，因而更加直观快速。。(2)本专利技术利用琼脂糖凝胶电泳直接检测，直观明了，比直接测序或者克隆测序缩短时间，降低了鉴定成本。(3)利用核心条形码ITS序列片段进行分子鉴定，比用形态学鉴定更为可行和可信。更详细的技术方案和专利技术效果参见《具体实施过程》。附图说明序列表SEQIDNO：1是紫杏分类学种以下材料‘紫杏’的一条短的ITS序列。序列表SEQIDNO：2是紫杏分类学本文档来自技高网...
【技术保护点】
如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO:3所示序列的遗传标记在紫杏鉴定中的应用，其特征在于，所述的应用包括下列步骤(1)从待测杏属材料中提取基因组DNA；(2)以登陆号为KX890450与登陆号KX890452和登陆号为KX890451与KX890449两条ITS序列作为模板设计引物，进行PCR扩增：所述引物的序列如下所述：ITS‑5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG‑3，ITS‑4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；(3)按照如下反应体系进行：在50μL体系中含有1×Buffer，1.5mmol/L Mg2+，0.20mmol/L dNTPs，引物各0.20mmol/L，Taq DNA聚合酶1U，0.1mg/mL BSA，4％DMSO，30‑50ng模板DNA；(4)按照如下程序扩增：96℃预变性5min，96℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸至7min；(5)将所得的PCR产物用0.5％琼脂糖电泳进行检测，按照如下步骤进行：待凝胶完全凝固，小心拔去梳子；将电泳样品依次加入点样孔中；将制胶板放入电泳槽中，使电泳缓冲液淹没过凝胶1mm，打开电泳仪，使核酸样品由负极向正极泳动，电泳时间为35min；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入凝胶成像系统中观察电泳结果，并照相记录；对跑胶带进行研判，若在一个泳道上同时出现2条分子量大小为750bp和720bp片段鉴定为紫杏，若仅仅有一条720bp的片段鉴定为其他类型的杏。...
【技术特征摘要】
1.如SEQIDNO：2和SEQIDNO:3所示序列的遗传标记在紫杏鉴定中的应用，其特征在于，所述的应用包括下列步骤(1)从待测杏属材料中提取基因组DNA；(2)以登陆号为KX890450与登陆号KX890452和登陆号为KX890451与KX890449两条ITS序列作为模板设计引物，进行PCR扩增：所述引物的序列如下所述：ITS-5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，ITS-4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；(3)按照如下反应体系进行：在50μL体系中含有1×Buffer，1.5mmol/LMg2+，0.20mmol/LdNTPs，引物各0.20mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，0.1mg/mL...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭玲，周慧杰，罗华平，
申请(专利权)人：塔里木大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65
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