安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：(1)选择对照动物模型；(2)样品采集；(3)耳组织DNA提取；(4)PCR扩增TAP1基因目的片段；(5)单链构象多态性分析；(6)PCR扩增产物双向测序；(7)群体遗传学特性分析；(8)血清免疫指标的测定；(9)用数学模型分析所检测到的TAP1基因遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性。旨在寻找与安徽地方猪种抗病性状相关的有效遗传标记，为安徽地方猪种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学参考。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记 的筛选方法。
技术介绍
我国是生猪养殖大国，也是猪肉消费大国，随着社会的发展，生猪养殖规模化程度 越来越高，各种疾病的预防和控制变得更加重要和严峻。提高猪群的一般抗病力，有助于降 低生产成本，更有利于减少药物残留，提高猪肉产品质量、公共卫生安全及动物福利等。研 宄发现，一些猪病的发病机制是和猪本身的遗传背景相关的，因此应用遗传学方法，从遗传 基础上提高猪对疾病的抗性具有治本的功效。随着猪基因组学和免疫学的发展，各种抗性 相关基因的核酸序列和功能的研宄为猪抗病育种有效遗传标记的筛选和确定提供了可能。抗原处理相关转运体 1(transporterlassociatedwithantigen processing,TAPI)是参与介导细胞内源性抗原与MHCI类分子结合以供T细胞识别过程中 一个重要的组成部分，在免疫应答中起着重要的作用，与机体的一般抗病力有着密切关系。 在人类上的研宄已表明，TAP基因的多态性会改变机体的免疫应答，影响个体对疾病的易感 性。猪TAP1基因位于7号染色体上，横跨8. 63kb，共11个外显子，编码746个氨基酸。在 猪上已有研宄表明TAP1基因外显子2G729A位点对TAP1基因表达和部分免疫指标具有明 显的遗传效应；且亦有研宄分析了TAP1基因作为猪抗病育种分子标记的可行性，结果表明 TAP1基因在杜洛克、长白、大白和皮特兰4个品种中表现出与相关生产性状无关，因此对它 抗病性能的选择利用将不会造成其他性能的下降。鉴于TAP1基因在动物机体免疫应答中 的重要性，对其多态性和遗传效应进行系统分析具有重要的理论和实践意义。 断奶仔猪腹泻以及水肿病是当今规模化猪场养殖中一种常见的疾病。在仔猪的饲 养管理过程中，断奶是一个极其重要的环节。仔猪断奶后，由于断奶应激，仔猪自身消化系 统尚未发育完全，再加上来自母体的抗体来源终止等外界不良因素的影响，常常易导致仔 猪断奶后发生腹泻（Post-weaning diarrhea, PWD)和水肿病（Oedema disease, 0D)，其中 F18大肠杆菌是最主要的致病源。至今为止，对于致病性大肠杆菌造成的危害，仍没有有效 的预防措施和治疗方法，给养猪业带来巨大的经济损失。 本专利技术所述研宄以安徽三个本地品种（圩猪、皖南黑猪及霍寿黑猪）和一个外来 品种大白猪为试验对象，检测在该四个群体中TAP1基因的遗传变异。通过测定在易感染 F18大肠杆菌的断奶培育时期仔猪的血清免疫指标，进行品种间的差异分析、以及基因型间 的关联性分析，探讨断奶仔猪血清免疫指标在不同品种间的差异以及TAP1基因多态性对 不同种群断奶仔猪血清免疫指标的遗传效应。旨在寻找与安徽地方猪种抗病性状相关的有 效遗传标记，为安徽省地方猪种种质资源特性及抗病育种研宄提供分子生物学参考。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛 选方法，本专利技术方法具有检测效果理想、成本低、操作简便的优点。 -种，包括如下步骤： (1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、霍寿黑猪、皖南黑猪与外来 猪种大白猪28日龄断奶仔猪为研宄免疫指标品种差异的对照动物模型； (2)样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血； (3)耳样组织DNA提取； (4)PCR扩增抗原处理相关转运体1 (transporter associated with antigen processing, TAPI)基因目的片段； (5)检测目的片段单链构象多态性分析（Single-StrandConformation Polymorphism,SSCP)； (6)PCR扩增产物双向测序； (7)群体遗传学特性分析； (8)仔猪血清免疫指标的测定； (9)采用数学模型分析所检测到的TAP1基因的遗传变异与血清免疫指标的关联 性，并分析品种间血清免疫指标的差异性。 根据TAP1 基因单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)与免疫 指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性的指标是否有影 响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的有效遗传标记。 本专利技术所述的，其中，所述步骤 (1) 中所述对照动物模型的选择为：35日龄的圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪及大白猪28日龄 断奶仔猪分别选择76、95、153、174头，其中圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限公司，皖 南黑猪采自绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，霍寿黑猪采自霍邱安徽浩宇牧业有限公 司，大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司。 本专利技术所述的，其中，所述步骤 (2) 中耳样组织采集过程为：提前在1. 5mL的Eppendorf管中注入70%体积分数浓度的酒 精，然后每头猪采耳组织块约1. 5g，装入所述Eppendorf管中，于-20°C保存备用。 本专利技术所述的，其中，所述步骤 (3) 中耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0.2g耳组织，去除其表面毛发及酒精，装 入1. 5mLEppendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北京全式金生物科 技有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至100ng/yL，放在2-8 摄氏度保存；④DNA纯度检测：取1yLDNA在SMA1000上测定0D260/0D280的比值（当 0D260/0D280的比值在1. 8-2. 0之间，说明所提DNA纯度较高）；⑤质量检测：将所提DNA用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量，以便进行后续实验。 本专利技术所述的，其中，所述步骤 (4) 中PCR扩增目的片段的过程为：以步骤（3)获得的耳组织样DNA为模板，根据GenBank 猪TAPI基因（登录号BX323833. 4)外显子1和外显子8序列，采用PrimerPremier5. 0 软件设计引物，进行TAPI基因外显子1和外显子8部分序列的克隆，并采用2%琼脂糖凝胶 电泳检测克隆产物是否为目的片段；其中引物TAPIexon-1的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO: 1和SEQIDNO: 2所示，引物TAPIexon-8的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 3和 SEQIDN0:4所示，退火温度及目的片段长度见表1。 本专利技术所述的，其中，所述步骤 (5) 中目的片段单链构象多态性的过程为：先将所述TAP1基因外显子1、8扩增产物进行非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行硝酸银染色后用凝胶成像系统观察电泳结果得到所述 断奶仔猪TAP1基因单链构象多态性。 其中，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具体包括如下步骤： (a)清洗制胶所用的玻璃板、夹子、软绳、样品梳等用具，晾干； (b)制板：将干净且干燥的底板磨面朝上（磨砂玻璃边的圆头朝下），用软绳封住 玻璃板的三面，夹子夹紧； ((：)配制10%的聚丙烯酰胺凝胶721^(双蒸水421^，30%的？46￡241^，10\丁8￡ 6mL，TEMED50yL，AP330yL)，混匀后快速灌胶； (d)将胶灌至玻璃板的边缘处后，插入梳子（此时注意检查胶中是否本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种安徽地方猪种抗病性状候选遗传标记的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、皖南黑猪、霍寿黑猪与外来猪种大白猪28日龄断奶的仔猪为研究免疫指标品种差异的对照动物模型；(2)样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血；(3)耳样组织DNA提取；(4)PCR扩增抗原处理相关转运体1即TAP1基因目的片段；(5)目的片段单链构象多态性即SSCP分析；(6)PCR扩增产物双向测序；(7)群体遗传学特性分析；(8)仔猪血清免疫指标的测定；(9)采用数学模型分析所检测到的TAP1基因的遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性；根据TAP1基因单核苷酸多态性即single nucleotide polymorphism：SNP与免疫指标的关联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性的指标是否有影响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的有效标记位点。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁月云，殷宗俊，薛玮玮，朱卫华，张晓东，黄龙，陈伟平，丁冲，张威，吴涛，朱树娇，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34