一种半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记及遗传性别鉴定方法，包括半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记的筛选、验证、雌性特异等位基因的克隆、序列分析、特异引物设计以及半滑舌鳎遗传性别鉴定的ＰＣＲ方法；根据获得的半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记引物及雌性特异等位基因序列，创建了半滑舌鳎遗传性别的ＰＣＲ鉴定方法。本发明专利技术首次筛选到半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记及雌性特异等位基因，建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的ＰＣＲ技术。本发明专利技术具有高效、准确和稳定的特点，在半滑舌鳎性别控制和单性苗种生产中具有重要应用价值，同时在克隆半滑舌鳎性别决定基因研究中也具有重要应用前景。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于水产生物
中的海水鱼类遗传性别分子标记鉴定技术，是一种与半滑舌鳎遗传性别连锁的微卫星标记及遗传性别鉴定方法。
技术介绍
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目(P1euronectiformes)、鳎亚目(Soleoidei)、舌鳎科(Cynoglossidae)、舌鳎属(Cynoglossus)、三线舌鳎亚属(Arelia)，为暖温带浅海底层大型鲆鲽鱼类，在黄渤海分布最多，而在东海、南海分布较少，是目前具有重要养殖前景的海水鲆鲽鱼类。周丽青等(中国水产科学研究院黄海水产研究所，水产学报，2005，29：417-419)对半滑舌鳎的染色体核型进行了研究，结果表明二倍体染色体数目为42，2n＝42，且在雌鱼的中期分裂相中存在异型性染色体，而在雄鱼中不存在异型性染色体。基于染色体C-带和G-带分析的进一步研究表明，半滑舌鳎由20对常染色体和1对性染色体(分别为Z和W染色体)组成，半滑舌鳎属于ZW/ZZ性别决定系统，雌性异配，雄性同配(Wu et al.，Progress inNatural Sciences，2006，16：29-32；Zhuang et al.，Journal of Applied Ichthyology，2006，22：437-440)。成熟的半滑舌鳎雌性个体比雄性个体大2-4倍，两者的生长速度也相差2-4倍，雌性个体生长速度更快。因此，积极开展半滑舌鳎性别连锁的分子标记或基因的研究，找到与性别连锁的分子标记或基因，将对半滑舌鳎性别控制与全雌苗种培育具有重要的理论意义与应用价值。目前，多国科学家利用基于全基因组扫描理念的一些分子标记技术，如AFLP、RAPD、RFLP等，筛选到了一些经济鱼类的与性别相关的分子标记，但这些标记在种间不具有通用性。中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林等(Marine Biotechnology，2007，9：273-280)通过AFLP标记技术分离到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记，转化成SCAR标记后能通过简单的PCR方法鉴定半滑舌鳎的遗传性别。但AFLP标记存在一个较大的缺陷，就是无法区分纯合子与杂合子，是一种显性遗传的分子标记。而微卫星标记是由1-6个碱基组成的短串联重复序列，具有高度多态性，并且符合孟德尔遗传分离规律，呈现共显性遗传的特点，能够区分纯合子和杂合子。微卫星重复序列的侧翼序列一般比较保守，一般在近缘物种中也能进行跨种扩增。因此如果能够筛选到半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记，不仅能够建立准确高效的遗传性别鉴定方法，还将有助于开展半滑舌鳎性别相关基因的进化研究以及WW超雌鱼的筛选。而有关半滑舌鳎性别连锁或特异微卫星标记的筛选研究，迄今国内外尚未见任何文献或专利报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一个半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记及遗传性别鉴定方法，为半滑舌鳎性别决定基因筛选、性别控制和全雌苗种培育提供一种技术手段。本专利技术是按以下技术方案实现的：本专利技术包括三个方面：一、半滑舌鳎性别连锁-->微卫星标记的筛选及其引物序列；二、半滑舌鳎雌性特异微卫星等位基因的序列及其引物序列；三、基于微卫星标记的半滑舌鳎遗传性别鉴定方法。一、半滑舌鳎性别连锁微卫星标记及其引物序列：它的
技术实现思路
包括：1、微卫星序列的筛选与克隆；2、微卫星引物的设计；3、性别连锁的微卫星标记的验证。1、微卫星序列的筛选与克隆：提取半滑舌鳎基因组DNA，首先对基因组DNA进行限制性酶切，再用T4连接酶给酶切DNA片段加上接头。连接产物用作PCR扩增模板，并用接头特异性引物进行PCR预扩增。将扩增片段与生物素标记的寡核苷酸探针进行杂交，并用磁珠选择性吸附与生物素标记探针杂交的DNA分子。然后在室温条件下经过3次非严谨性和3次严谨性洗脱去除未与探针结合的DNA片段，并用磁铁将磁珠-探针-DNA混合物从缓冲液中分离出来。接着往磁珠中添加TE溶液并在95℃水浴变性5分钟，用磁铁固定磁珠后快速吸出上清液。以上清液当模版进行PCR扩增，扩增产物经纯化后与pMD18-T载体(Takara)在16℃连接两个小时。将连接产物加入到感受态细胞中进行克隆并涂匀在一个含氨卞青霉素的LB平板上，等液体吸收完毕后，37℃倒置培养过夜。挑选白色的阳性克隆送到生物测序公司测序。2、微卫星引物的设计：根据测序得到的序列，查看其中是否含有1-6个碱基重复的单元。选取含有重复单元的序列，用引物设计软件针对重复单元的侧翼序列设计引物。3、性别连锁的微卫星标记的验证：首先用各16尾半滑舌鳎雄性个体与雌性个体基因组DNA样品对每对微卫星引物进行PCR扩增，扩增产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并通过银染方法进行染色，然后比较微卫星等位基因在雌雄个体中的分布是否有显著差异。最终筛选到一个引物序列为SEQID NO：1(tgaactgcaa gactgctcca)和SEQ ID NO：2(catcagttgg tggcctgtaa)微卫星标记与半滑舌鳎性别紧密连锁。然后进一步用序列SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的引物扩增性成熟的半滑舌鳎22尾雌鱼和22尾雄鱼基因组DNA，总共扩增出2个等位基因，按照大小顺序分别命名为A、B等位基因。根据与分子量标准比较，A等位基因大小约为244bp，B等位基因的大小约为234bp。其中22尾雄鱼和22尾雌鱼全部扩增出A等位基因，所有22尾雌鱼都扩增出B等位基因，而所有22尾雄鱼都未能扩增出B等位基因。因此B等位基因为半滑舌鳎雌性特异的等位基因。二、半滑舌鳎雌性特异的等位基因序列及其引物序列：它的
技术实现思路
包括：1、雌性特异等位基因的克隆与测序；2、雌性特异等位基因的引物设计；3、雌性特异标记的验证。1、雌性特异等位基因的克隆与测序：为了获得雌性特异等位基因序列，用SEQ ID NO：1(tgaactgcaagactgctcca)和SEQ ID NO：2(catcagttgg tggcctgtaa)的引物PCR扩增1尾性成熟的半滑舌鳎雌鱼DNA，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切下PCR产物目标电泳条带，用DNA纯化试剂盒纯化。纯化产物用T4 DNA连接酶连接到pMD 18-T质粒，然后转化感受态大肠杆菌，并涂匀在一个含氨卞青霉素的LB平板上，等液体吸收完毕后，37℃倒置培养过夜。挑选8个阳性克隆送到生物测序公司测序。2、雌性特异等位基因的引物设计：根据测序结果，8个阳性克隆测序成功，共得到8条序列，其中大小为244bp的序列6条，大小为234bp序列2条，分别对应A、B两个等位基因，B等位基因即为半滑舌鳎雌性特异等位基因。根据A、B等位基因的序列比对结果，-->除了重复区有2个GT的缺失，相对于A等位基因，B等位基因(即雌性特异等位基因)在5’端有6个碱基的缺失。因此用引物设计软件针对缺失的6个碱基的位置，设计了SEQ ID NO：3(tctgcatgac attggaaag)的一条特异引物，该引物与SEQ ID NO：2(catcagttgg tggcctgtaa)的引物配对用于扩增大小为204bp的半滑舌鳎雌性特异DNA片段，进行半滑舌鳎遗传性别检测。雌性特异等位基因(大小为234bp的B等位基因)序列为SEQ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记，其特征在于它的技术内容包括３条特异引物ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３以及雌性特异等位基因的核苷酸序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４，其序列为： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ｔｇａａｃｔｇｃａａ ｇａｃｔｇｃｔｃｃａ； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ｃａｔｃａｇｔｔｇｇ ｔｇｇｃｃｔｇｔａａ； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：ｔｃｔｇｃａｔｇａｃ ａｔｔｇｇａａａｇ； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ｔｇａａｃｔｇｃａａ ｇａｃｔｇｃｔｃｃａ ｇｇｇｃａｇｔｇｔｃ ｔｃｔｇｃａｔｇａｃ ａｔｔｇｇａａａｇｃ ｔｇｔｇｔｇｔｇｇａ ｔｇｃａｔｇｔｇｔｇ ｔｇｔｇｃｇｔｇｔａ ａｔｇｔｔｃｔｃｃａ ｇｃｔａｔｇｇｃｃｔ ａｃｇｃｔｇｇｃｔｇ ｃａｇｃｃｔｇｇａｇ ｃｃｇｃｔｃｔｇｔｇ ｇｔｇｔｇｇａａａａ ｇａｇａｇｃａｇａｔ ｇｃｃｔｃｔｔｃａｃ ｔｇｇａｇｔｇｃａｔ ｃａｇｇｃｃａｃｃａ ａａｔｃｇｃａａａｔ ａｔｃａｃｔｇａｔｃ ａｔｃｔｃｃｃａａｔ ｔｃａａｔｔａｃａｇ ｇｃｃａｃｃａａｃｔ ｇａｔｇ。
【技术特征摘要】
1.一种半滑舌鳎性别连锁的微卫星标记，其特征在于它的技术内容包括3条特异引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3以及雌性特异等位基因的核苷酸序列SEQ ID NO：4，其序列为：SEQ ID NO：1：tgaactgcaa gactgctcca；SEQ ID NO：2：catcagttgg tggcctgtaa；SEQ ID NO：3：tctgcatgac attggaaag；SEQ ID NO：4：tgaactgcaa gactgctcca gggcagtgtc tctgcatgacattggaaagc tgtgtgtgga tgcatgtgtg tgtgcgtgta atgttctcca gctatggcctacgctggctg cagcctggag ccgctctgtg gtgtggaaaa gagagcagat gcctcttcactggagtgcat caggccacca aatcgcaaat atcactg...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖小林，陈松林，徐亘博，徐营，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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