一种含千层纸素用于治疗白血病的组合物及其应用制造技术

本发明专利技术属于抗肿瘤药物领域，公开了一种含千层纸素用于治疗白血病的组合物及其应用。该药物组合物的活性成分包含千层纸素和肿瘤坏死因子。该药物组合物对白血病具有较好的疗效，可用于制备抗白血病药物，具有较好的临床价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗肿瘤药物领域，涉及一种含千层纸素用于治疗白血病的组合物及其应用。
技术介绍
千层纸素(OroxylinA)是黄芩的活性组分之一，具有明显的抗肿瘤作用，是一个具有广阔应用前景的天然抗肿瘤药物。目前不少文献对千层纸素的抗肿瘤作用及诱导凋亡和周期阻滞进行了系统的研究，发现千层纸素对体外培养的人肝癌细胞HepG2有显著的生长抑制作用，且对ICR小鼠实验性移植瘤S180也具有显著的生长抑制作用，抑制率最高可达40％以上，作用于低分化人胃腺癌细胞株BGC-823导致其周期阻滞于G2/M期，提示千层纸素可以诱导肿瘤细胞凋亡，并且可以针对细胞周期检测点调控肿瘤细胞生长。但是目前没有千层纸素对白血病影响的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种含千层纸素的抗白血病组合物。本专利技术的另一个目的是提供上述组合物在制备治疗白血病药物中的应用。全反式维甲酸(ATRA)的治疗对U937和HL-60等非急性早幼粒细胞白血病无效，TNFα可促进U937和HL-60分化，但分化过程中有明显的副作用抑制其分化效果，千层纸素联用TNFα可增敏细胞对TNFα的反应。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：一种药物组合物，该药物组合物的活性成分包含千层纸素和肿瘤坏死因子。所述的药物组合物的活性成分含有下列浓度比例的组分：千层纸素10～50μM：肿瘤坏死因子10～20ng/mL。所述的药物组合物在制备治疗白血病的药物中的应用。所述的白血病为急性髓系白血病。本专利技术的有益效果：本专利技术通过实验证明了千层纸素与TNFα联用能够增强TNFα抑制人白血病细胞株NB4、细胞株U937-MDR以及细胞株HL-60-resistant的活力，也能增强TNFα抑制人AML原代细胞的活力，延长人AML原代细胞接种小鼠的生存期，可用于制备治疗白血病的药物，具有较好的临床应用前景。附图说明图1：千层纸素增强TNFα对AML细胞活力的抑制。图2：千层纸素增强TNFα对AML细胞活力的抑制。图3：TNFα联用千层纸素延长人AML原代细胞接种小鼠的生存期。具体实施方式：以下通过实施例对本专利技术作进一步的阐述。实施例1本研究主要是将黄酮类抗肿瘤化合物与抗肿瘤药物肿瘤坏死因子TNFα联合，用于治疗急性髓系白血病(AML)。通过体内外研究发现，千层纸素能够与TNFα联合增效。1、实验材料1.1试剂(1)千层纸素(oroxylinA)购自江苏省肿瘤发生与干预重点实验室(中国药科大学)，使用前用二甲亚砜(DMSO)将药物粉末配制为0.5M的浓度的母液，临用前用细胞培养液配成所需浓度。全反式维甲酸(ATRA)购自美国Sigma公司，溶解于DMSO配制成浓度为20mM的母液。(2)重组人肿瘤坏死因子α(TNFα)购自Prospec-TanyTechnoGene股份有限公司。使用前先用无菌水将粉末配置成1.0mg/ml浓度的母液，再用0.1％BSA将其稀释为1μg/ml的储备液，-20℃分装保存。临用前用细胞培养液配成所需浓度。(3)细胞培养试剂①培养液：RPMI-1640培养基，购自美国GIBCO公司。取RPMI-1640粉末10.39g溶于1000ml灭菌三蒸水中，并加入2.0gNaHCO3，用1M盐酸调pH值至7.0，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素。②胎牛血清：美国GIBCO公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。③PBS缓冲液：称取NaCl8.0g、KCl0.20g、Na2HPO4·H2O1.56g、KH2PO42.0g，溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。(4)淋巴细胞分离液，南京晶美公司产品。(5)MTT贮液(5mg/ml溶于PBS)：美国Sigma公司产品。取MTT粉末1.0g溶于20mlPBS溶液中，避光超声溶解。(6)细胞分化检测相关试剂人抗鼠CD11b-PE，anti-CD14-FITC抗体购自Miltenyi公司。牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin，BSA)购自瑞士Roche公司。(7)全反式维甲酸(ATRA)购自美国Sigma公司，溶解于DMSO配制成浓度为20mM的母液。(8)千层纸素(oroxylinA)购自江苏省肿瘤发生与干预重点实验室(中国药科大学)，做成静脉注射剂。(9)重组人肿瘤坏死因子α(TNFα)(500,000IU/ml)购自上海维科生物医药有限公司。小鼠静脉注射(3,000IU/kg)。1.2实验仪器(1)YJ-875型医用净化工作台：苏州净化设备厂生产。(2)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermoelectron公司产品。(3)电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。(4)ELX800酶联免疫检测仪：美国Bio-tek公司产品。(5)QIUJING血细胞计数板：中国上海求精生化试剂仪器有限公司产品。(5)Olympus相机：日本Olympus公司产品。(6)LD4-2普通离心机：北京医用离心机厂产品。(7)5417R型台式冷冻高速离心机：德国Eppendorf公司产品。(8)THZ-312型台式恒温振荡器：上海精宏试验设备有限公司产品。1.3细胞株人白血病细胞株NB4购自上海中国科学院细胞所，细胞株U937-MDR和HL-60-resistant由阿尔伯特.爱因斯坦医学院的RobertE.Gallagher教授实验室构建，通过广州吉妮欧生物科技有限公司购买。人AML原代细胞购买于江苏省人民医院血液科。所有细胞均用含100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养。NB4为急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株，U937-MDR为U937多药耐药株，HL-60-resisitant为HL-60的全反式维甲酸ATRA耐药株。分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)对NB4有效，作为阳性对照；U937和HL-60都是非急性早幼粒细胞白血病的急性髓系白血病(AML)，都无法响应全反式维甲酸(ATRA)的治疗。1.4实验动物品系：NOD/SCID小鼠；周龄：6-8周；体重：18-22g；饲养条件：颗粒饲料；SPF空调房间，温度18-24℃，相对湿度70％。购自中国科学院上海实验动物中心。2、实验方法2.1淋巴细胞分离液分离人白血病细胞人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞按相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。将无菌的10ml离心管中加入2ml淋巴细胞分离液。将2ml肝素抗凝管(或枸橼酸钠)中的静脉血与等量无血清培养基充分混匀后，用移液器沿管壁缓慢滴加于分层液面上，注意保持清楚的界面。2000rpm离心20min。离心后管内分为三层在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾狭窄带。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。用毛细管或吸头插到云雾层，吸取单个核细胞。然后置于另一离心管中。加入5倍体积的无血清培养基液洗涤，上下颠倒数次混匀，15本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药物组合物，其特征在于该药物组合物的活性成分包含千层纸素和肿瘤坏死因子。

【技术特征摘要】
1.一种药物组合物，其特征在于该药物组合物的活性成分包含千层纸素和肿瘤坏死因子。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的活性成分含有下列浓度关系的组分：千层纸素1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭青龙，魏立彬，惠慧，卢娜，赵丽，周煜新，张晓博，赵凯，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32