本发明专利技术公开了一种利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，采用HPLC方法，色谱条件为：流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液，流动相B：0.02％三氟乙酸的甲醇‑乙醇混合溶液，梯度洗脱；所述多种脂溶性维生素选自维生素A、D2、D3、α‑生育酚、β‑生育酚、γ‑生育酚、δ‑生育酚、K1、K2或Q10。本发明专利技术通过对样本前处理方法和高效液相色谱条件的优化，建立了一种同时检测血清中多种脂溶性维生素的方法，可进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、快速、通量高、结果可靠、低成本的检测方法，具有特异性强，灵敏性高，操作简单，成本低等优点，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，属于维生素检测
技术介绍
维生素是机体维持正常代谢和机能所必须的一类低分子化合物，是人体七大营养要素之一，分为脂溶性和水溶性维生素两类，人体内维生素必须保持在一个合适的范围才对人体有益，无论缺乏还是升高都会给人体带来危害。维生素A、D2、D3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、K1、K2和Q10均属于脂溶性维生素，人体缺乏这些维生素时会表现出不同的症状：A缺乏易致夜盲症、眼部炎症等，D缺乏易致儿童佝偻病、成人骨质软化病、老人骨质疏松症等，E(其水解产物为生育酚)缺乏易导致新生儿溶血性贫血、神经系统疾病等，K缺乏致凝血功能障碍、血液凝固时间延长和出血，Q10缺乏会造成心脏动力不足，进而引发一系列心脏问题如：心肌埂塞、心绞痛等。近年来，国内外对维生素认识的重要性在不断提高，根据统计，维生素在美国保健品市场占有主要份额。随着国际维生素市场对中国乃至亚洲市场的不断冲击，以及国内科研单位和企业在维生素行业取得的科研成果和技术突破，我国公民自身的保健意识不断增强，随着居民收入水平提高，人们开始补充各类维生素，但是，由于缺乏科学的指导，维生素产品的使用现状很混乱，一些人群为了提高身体各项机能，不惜花重金在保健品上，盲目补充维生素，据2014年中国营养学会调查显示，中国居民由于营养过剩或营养不均衡导致的疾病在逐年增多。如何了解人体是否需要补充所必需的十类脂溶性维生素，只有通过检测体内各种维生素的真实状态，根据检测结果有针对性的调整需要的维生素，检测是科学评估和个性化使用维生素唯一的依据。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，采用HPLC方法，色谱条件为：流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液(体积浓度)，流动相B：0.02％三氟乙酸的甲醇-乙醇混合溶液(体积浓度)(甲醇与乙醇的体积比为3:1)，梯度洗脱；所述多种脂溶性维生素选自维生素A、D2、D3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、K1、K2或Q10中任意两种以上。所述血清，进行以下前处理：将血清置于半自动液液萃取仪(现有技术中已有的常规设备)中，先加入有机溶剂(优选甲醇、乙腈、乙醇，更优选冷冻乙醇)，再加入萃取剂正己烷，分两次萃取，萃取液氮吹后的残渣用冷冻乙醇溶解，涡旋，离心，过0.2um滤膜，进样分析。进一步地，色谱条件为：色谱柱：WatersXBridgeC183.5um4.6*250mm；柱温：35℃；进样体积：20μl；流速：0.75ml/min；切换波长如表1所示；梯度洗脱条件如表2所示。表1波长切换参数时间(min)波长(nm)0325(VA)6.5250(D2)8.30265(D3)10.0292(生育酚)17.0248(K1)19.5254(K2)21.5275(Q10)30.0325表2梯度洗脱条件：优选的，利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，步骤如下：(1)样品前处理：将血清置于半自动液液萃取仪中，先加入等体积的冷冻乙醇，再加入萃取剂正己烷，分两次萃取，萃取液氮吹后的残渣用冷冻乙醇溶解，涡旋，离心，过0.2um滤膜，进样分析；(2)标准工作液的配制：以含10ug/mL2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇-乙醇混合溶液(甲醇与乙醇的体积比为3：1)配制100μg/mL各维生素标准品储备液，然后用浓度为5％(单位g/ml)的BSA(牛血清白蛋白)甲醇溶液制备5个梯度(维生素A：100、250、500、1000、2000ng/mL；维生素D2、D3：10、25、50、100、200ng/mL；δ-生育酚：0.05、0.1、0.5、1、2μg/mL；γ-生育酚：0.1、0.5、1、2、4μg/mL；α、β-生育酚：0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μg/mL；维生素K1、K2：0.05、0.1、0.5、1、2ng/mL；Q10：0.1、0.5、1、2.5、5μg/mL)的混合标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用；(3)HPLC检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，在表1所示的设定检测波长下，对待测物质进行定性(以各种维生素的相对保留时间作为定性依据)与定量检测(以标准品制作标准曲线定量)。进一步地，进行定量检测时，应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴，进行线性回归分析得回归方程；将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中多种脂溶性维生素的浓度。本专利技术通过对样本前处理方法和高效液相色谱条件的优化(通过具体实验，优化出通用的流动相和流速梯度以及检测波长，优化血清的前处理方法，从而可以同时检测出多种维生素)，建立了一种同时检测血清中多种脂溶性维生素的方法。采用本专利技术可以同时检测人血清中多种脂溶性维生素A、D2、D3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、K1、K2和Q10的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、快速、通量高、结果可靠、低成本的检测方法。本专利技术中使用的样品处理方法，可以较多的去除杂质，降低检测时的基质效应，且操作简单快捷，使用半自动液液萃取仪设备，准确地控制萃取过程中加样取样操作的准确性，这样就能够保证最后结果的重现性和实验效率。半自动液液萃取仪大大降低了操作人员与有机溶剂的接触几率，使操作人员不再受有机溶剂的危害。本专利技术采用高效液相色谱法检测血清中多种脂溶性维生素，特异性强，灵敏性高，通量高，操作简单，成本低(可以达到和质谱检测器相当的检测水平，但本专利技术的检测成本要远远低于质谱)，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。基于该方法不仅可以对营养性疾病患者进行病因诊断，还可以对潜在的维生素缺乏者进行用药指导，减少盲目补充维生素的现象发生。附图说明图1：血浆样品1的色谱图。图2：血浆样品2的色谱图。图3：维生素A的标准曲线示意图。图4：维生素D2的标准曲线示意图。图5：维生素D3的标准曲线示意图。图6：α-生育酚的标准曲线示意图。图7：β-生育酚的标准曲线示意图。图8：γ-生育酚的标准曲线示意图。图9：δ-生育酚的标准曲线示意图。图10：维生素K1的标准曲线示意图。图11：维生素K2的标准曲线示意图。图12：维生素Q10的标准曲线示意图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例1利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素步骤如下：(1)制备待测样本：将200ul血清样本置于半自动液液萃取仪中，先加入等体积的冷冻乙醇，涡旋2分钟，然后加入800ul冷冻的0.4g/L2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷溶液，1500rpm涡旋10分钟，然后本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：采用HPLC方法，色谱条件为：流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液，流动相B：0.02％三氟乙酸的甲醇‑乙醇混合溶液，甲醇与乙醇的体积比为3:1，梯度洗脱；所述脂溶性维生素选自维生素A、D2、D3、α‑生育酚、β‑生育酚、γ‑生育酚、δ‑生育酚、K1、K2或Q10中任意两种以上；所述血清进行以下前处理：将血清置于半自动液液萃取仪中，先加入有机溶剂，再加入正己烷，分两次萃取，萃取液氮吹后的残渣用冷冻乙醇溶解，涡旋，离心，过0.2um滤膜，进样分析；所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇。
【技术特征摘要】
1.一种利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：采用HPLC方法，色谱条件为：流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液，流动相B：0.02％三氟乙酸的甲醇-乙醇混合溶液，甲醇与乙醇的体积比为3:1，梯度洗脱；所述脂溶性维生素选自维生素A、D2、D3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、K1、K2或Q10中任意两种以上；所述血清进行以下前处理：将血清置于半自动液液萃取仪中，先加入有机溶剂，再加入正己烷，分两次萃取，萃取液氮吹后的残渣用冷冻乙醇溶解，涡旋，离心，过0.2um滤膜，进样分析；所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇。2.根据权利要求1所述的利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：所述脂溶性维生素为维生素A、D2、D3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、K1、K2与Q10。3.根据权利要求1所述的利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：HPLC所用色谱柱为WatersXBridgeC18。4.根据权利要求1～3中任一项所述的利用半自动样本处理液相色谱技术同时测定血清中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于：色谱条件为：色谱柱：WatersXBridgeC183.5um4.6*250mm；柱温：35℃；进样体积：20μl；流速：0.75ml/min；切换波长如表1所示；梯度洗脱条件如表2所示；表1波长切换参数时间(min)波长(nm)0325(VA)6.5250(D2)8.30265(D3)10.0292(生育酚)17.0248(K1)19.5254(K2)21.5275(Q10)30.0325表2梯度洗脱条件：时间(分钟)A％B％0.015852.010904.05955.62988....
【专利技术属性】
技术研发人员：陈大为，
申请(专利权)人：陈大为，
类型：发明
国别省市：山东;37
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