转基因猪胰岛和其用于治疗糖尿病的用途制造技术

本发明专利技术涉及一种分离的转基因猪β细胞，其中PKC和PKA路径被组成性地激活；一种转基因猪胰岛，其包含所述转基因猪β细胞；以及一种转基因猪，其包含所述转基因猪β细胞或所述转基因猪胰岛。本发明专利技术的另一个目标是一种包含本发明专利技术的转基因猪β细胞或转基因猪胰岛的装置。本发明专利技术还涉及所述转基因猪β细胞、所述转基因猪胰岛或所述装置用于治疗与内分泌胰腺或β细胞的功能受损相关的疾病、病症或病状的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及糖尿病治疗领域。本专利技术尤其涉及通过移植来自猪的朗格汉斯岛来治疗糖尿病，其中PKA和PKC路径被转基因地修饰，优选地被组成性地激活。
技术介绍
I型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)或青少年糖尿病，这是一种慢性病。主要症状是高于正常值的血糖过高，这是由于朗格汉斯岛的β细胞无法生产胰岛素引起的。在绝大多数患者中，β细胞被T细胞所介导的自身免疫攻击破坏。常规治疗是每天注射胰岛素，以便补偿胰腺产量的不足。然而，虽然可以挽救生命，但是用胰岛素治疗通常并不提供对血糖的充分控制，不能预防该疾病的威胁生命的并发症。因此目前开发了其它治疗。一些是基于胰腺或朗格汉斯岛移植以恢复胰岛素的正常生产。同种异体移植(将人来源的器官移植给人)因为人胰岛组织的短缺以及每名接受者需要若干胰腺而受到限制。因此需要产胰岛素细胞的替代来源。猪胰岛代表人胰岛移植的一个有前景的替代方案，因为其可以大量获得而不会引起伦理问题。猪β细胞所产生的胰岛素与人胰岛素只有一个氨基酸不同，并且已经长期用于治疗糖尿病病人。此外，对猪细胞的基因改造在技术上是可能的并且应当解决与不协调的胰岛异种移植相关的若干问题，例如通过最小化所需胰岛的数目和血栓形成的风险两者(Dufrane&Gianello,Transplantation,2008,86(6),753:60)。此外，在异种移植模型中的免疫抑制可以通过微囊封/巨囊封方法克服(Dufrane等人,2010,Transplantation,90(10):1054-1062；WO2007/144389和WO2010/032242)。近十年来已经公开了若干临床前猪到非人灵长动物研究，得到关于在接受者内产生胰岛素的有前景的结果(清单请参见Dufrane&Gianello,Transplantation,2008,86(6),753:60)。具体来说，临床研究目前针对人糖尿病患者，例如通过使用由LivingCellTechnologies研发的产品其包括用海藻酸盐囊封的猪胰岛。然而，猪胰岛对葡萄糖刺激显示相对弱的应答。当通过将葡萄糖浓度从静止水平(1-2mM)增加到刺激水平(8-15mM)来刺激分离的猪胰岛时，胰岛素分泌的增加介于1.5倍与3倍之间(Crowther等人1989,Horm.Metabol.Res,21:590-595；Bertuzzi等人1995,FEBESLetters379:21-25；Dufrane等人2007,Diabetes&Metabolism33:430-438；Mueller等人2013,Xenotransplantation,20:75-81)。相比之下，当利用葡萄糖浓度的类似增加激发人、灵长动物或啮齿动物胰岛时，胰岛素分泌增加12到16倍(Dufrane等人2007；Mueller等人2013)。当被移植到胰岛素需求更高的生物体(例如非人灵长动物，且可能是人)中时，猪胰岛的这种特性有时会令人对其作为糖尿病治疗的效用产生怀疑。具体来说，与人胰岛相比，猪胰岛对血糖的应答更低，这导致需要移植大量的猪胰岛以充分校正人葡萄糖水平，这也是治疗方法的一个缺点，因为为了移植一名患者目前要使用若干头猪。因此需要一种通过猪胰岛的异种移植治疗糖尿病患者的改良方法。在人β细胞中，响应于血糖水平的胰岛素合成和分泌可能涉及两种路径：(i)PKC路径，和(ii)PKA路径。本文的申请人意外地证实，两种路径的组成性激活导致胰岛素分泌的协同增加。这个结果尤其出乎意料，因为之前在现有技术中证实，在小鼠中PKC和PKA对胰岛素分泌的作用甚至不具有累加性(Yang&Gillis,J.Gen.Physiol.,2004,124:641-651；Wan等人,J；Gen.Physiol.,2004,124:653-663)。本专利技术因此涉及一种其中PKC和PKA路径被组成性地激活的转基因猪β细胞、转基因猪胰岛和转基因猪，并且涉及其用于在有需要的受试对象中治疗糖尿病的用途。
技术实现思路
本专利技术因此涉及一种分离的转基因猪β细胞，其中PKC和PKA路径被组成性地激活。在一个实施方案中，所述细胞包含组成性活性的乙酰胆碱受体，优选毒蕈碱性受体，更优选III型毒蕈碱性受体。在一个实施方案中，组成性活性的III型毒蕈碱性受体具有氨基酸序列SEQIDNO:4，或与SEQIDNO:4具有至少70％序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述细胞表达GLP-1。在一个实施方案中，GLP1具有氨基酸序列SEQIDNO:6，或与SEQIDNO:6具有至少70％序列同一性的序列。本专利技术还涉及一种分离的转基因猪胰岛，其包含本专利技术的猪β细胞。本专利技术的另一个目标是一种用于获得本专利技术的分离的转基因猪β细胞或本专利技术的分离的转基因猪胰岛的离体方法，其中所述方法使用包含编码组成性活性的III型毒蕈碱性受体的核酸序列的表达载体，和包含编码GLP-1的核酸序列的表达载体。本专利技术的另一个目标是一种分离的转基因猪β细胞或分离的转基因猪胰岛，其通过用于获得本专利技术的分离的转基因猪β细胞或本专利技术的分离的转基因猪胰岛的离体方法而获得。本专利技术还涉及一种转基因猪，其包含本专利技术的分离的转基因猪β细胞或分离的转基因猪胰岛。本专利技术还涉及一种装置，其包含本专利技术的分离的转基因猪β细胞或分离的转基因猪胰岛。在一个实施方案中，所述分离的转基因猪β细胞或所述分离的转基因猪胰岛囊封在海藻酸盐组合物中。本专利技术的另一个目标是本专利技术的分离的转基因猪β细胞或分离的转基因猪胰岛或装置，其用于治疗与内分泌胰腺或β细胞的功能受损相关的疾病、病症或病状。在一个实施方案中，所述与内分泌胰腺或β细胞的功能受损相关的疾病、病症或病状选自包括以下的组：I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隐匿性自身免疫糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎缩性糖尿病、青年成熟期发病型糖尿病、新生儿糖尿病(例如永久性新生儿糖尿病或暂时性新生儿糖尿病)、前驱糖尿病、类固醇诱导的糖尿病、胰腺癌，尤其是内分泌胰腺癌，例如内分泌胰腺肿瘤和胰腺神经内分泌癌。本专利技术的另一个目标是本专利技术的分离的转基因猪β细胞或分离的转基因猪胰岛或装置，其用于在有需要的受试对象体内调控血糖水平。本专利技术的另一个目标是本专利技术的分离的转基因猪β细胞或分离的转基因猪胰岛或装置，其用于在有需要的受试对象体内恢复正常胰岛素分泌水平。定义在本专利技术中，以下术语具有以下含义：‐“分离的”是指器官、组织或细胞已经从其天然环境中分离并且至少约75％不含、80％不含、85％不含且优选地约90％、95％、96％、97％、98％、99％不含与其天然地一起存在的其它细胞，但是缺少分离所述细胞所基于的细胞表面标志物。该术语包括从天然环境总体物理分离，例如从供体动物移除，和通过离解改变器官、组织或细胞与其邻近细胞或与其直接接触的细胞的关系。细胞群体的分离方法在所属领域是众所周知的并且包括(但不限于)通过流式细胞术、磁性选择、亲和色谱法、淘选或其组合的细胞分选。‐“协同作用”定义两种或更多种试剂的相互作用，它们以积极方式一起作用以产生比单独工作的每种试剂的作用的总和更大的作用。‐数字前的“约”意味着所述数字的值的加或减10％。‐“治疗”是指治疗性治疗；其中目的是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的转基因猪β细胞，其中PKC和PKA路径被组成性地激活。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.11 EP 14164372.6;2014.12.22 EP 14199910.21.一种分离的转基因猪β细胞，其中PKC和PKA路径被组成性地激活。2.根据权利要求1所述的分离的转基因猪β细胞，其中所述细胞包含组成性活性的乙酰胆碱受体，优选毒蕈碱型受体，更优选III型毒蕈碱型受体。3.根据权利要求2所述的分离的转基因猪β细胞，其中所述组成性活性的III型毒蕈碱型受体具有氨基酸序列SEQIDNO:4，或与SEQIDNO:4具有至少70％序列同一性的序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的转基因猪β细胞，其中所述细胞表达GLP-1。5.根据权利要求4所述的分离的转基因猪β细胞，其中GLP1具有氨基酸序列SEQIDNO:6，或与SEQIDNO:6具有至少70％序列同一性的序列。6.一种分离的转基因猪胰岛，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的猪β细胞。7.一种用于获得根据权利要求1至5中任一项所述的分离的转基因猪β细胞或根据权利要求6所述的分离的转基因猪胰岛的离体方法，其中所述方法使用包含编码组成性活性的III型毒蕈碱型受体的核酸序列的表达载体，和包含编码GLP-1的核酸序列的表达载体。8.一种分离的转基因猪β细胞或分离的转基因猪胰岛，其通过根据权利要求7所述的方法获得。9.一种转基因猪，其包含根据权利要求1至5中任一项或权利要求8所述的分离的转基因猪β细胞，或根据权利要求6或8所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·吉亚内洛，N·穆拉德，
申请(专利权)人：卢万天主教大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE