一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用，以羊胎盘下脚料为原料，通过木瓜蛋白酶酶解，再经过大孔吸附树脂、超滤膜、葡聚糖凝胶色谱和半制备RP‑HPLC反相高效液相色谱进行分离纯化，收集后冷冻干燥，得到高抗氧化活性的羊胎盘多肽，其氨基酸序列为：Glu‑Pro‑Val‑Ser‑His‑Phe。采用本发明专利技术的方法能有效利用羊胎盘加工的废弃物，提高附加值，增加经济效益，且具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点，通过本发明专利技术的方法能够获得具有高抗氧化活性的天然多肽，可替代人工合成的抗氧化剂使用，例如作为抗衰老化妆品中的功能原料，制成乳液、晚霜、眼霜、凝露、精华素、面膜等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用。
技术介绍
自古以来，胎盘以其药用价值为历代名医重视，并被视为中药珍品。与其它动物胎盘相比，羊胎盘与人胎盘的结构和成分最为相似，具有良好的营养价值。现代医学研究发现，羊胎盘中含有大量的表皮细胞生长因子、透明质酸刺激因子等生物活性因子，多种促进、改善组织新陈代谢的酶，17种氨基酸和14种矿物元素。而利用科学方法从羊胎盘中提取、纯化的活性物质，其主要成分为小分子多肽，具有提高机体免疫力、抗衰老、抗癌等作用，广泛应用于医疗保健、食品、化妆品等领域(KovoM,SchreiberL,Ben-HaroushA,etal.Placenta,2013,34:320-324)。我国是养羊第一大国，羊资源丰富，目前羊存栏数达到4亿只，每年可被开发的羊胎盘潜藏量高达450万个。目前，羊胎盘抗氧化肽主要通过匀浆、低温离心、超滤的工艺从羊胎盘中提取得到，但产率极低且浸提液中的多肽及氨基酸含量甚微。绝大多数研究工作对提取过程中离心后的沉淀直接舍弃(刘隆兴,任兴宏,汤禾静,等.食品科学,2013,34:273-276；刘旺旺,侯银臣,程永霞.中国酿造,2014,33:89-93；吴开平,魏泓,刘宇.药物生物科技,2005,12:393-396)，而此物料富含蛋白质，若进一步水解成小分子活性肽，可使胎盘的应用价值得到充分的利用，具有广阔的市场经济效益。蛋白质水解产生活性肽主要有酶法和化学法。化学法采用酸碱水解制备活性肽，对氨基酸会产生破坏作用，并且水解产物分子组成差异大、生产费用高。而酶法水解蛋白质的生产条件温和、安全性高、易于控制，因此已成为目前制备生物活性肽的主流方法(NazeerRA,SrividhyaTS.InternationalJournalofPeptideResearchandTherapeutics,2011,17:231-237；TanzadehpanahH,AsoodehA,ChamaniJ.FoodResearchInternational,2012,49:105-111；NaqashSY,NazeerRA.Peptides,2012,43:337-345)。综上可知，目前尚未存在以羊胎盘下脚料作为原料，对其进一步利用，并通过优化工艺操作而获得具有功能活性特别是抗氧化活性的多肽产物；因此，如何实现资源的充分利用、提高产品附加值，并获得更加天然、高效的化妆品，成为本领域急需解决的一大技术难题。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种羊胎盘抗氧化多肽及其酶解制备方法与应用。本专利技术能有效利用羊胎盘加工的废弃物，提高附加值，增加经济效益，且具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点。通过本专利技术的方法能够获得高抗氧化活性的天然多肽，可替代人工合成的抗氧化剂使用，例如作为抗衰老化妆品中的功能原料，制成眼霜、乳液、晚霜、凝露、精华素、面膜等。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下所述：本专利技术首先提供了一种羊胎盘抗氧化多肽的酶解制备方法，包括以下步骤：(1)原料选择与酶解：选择羊胎盘下脚料为原料，采用木瓜蛋白酶对其进行酶解；(2)除糖脱盐处理：将步骤(1)中获得的酶解产物通过大孔吸附树脂，先用去离子水洗脱层析柱，以除去其中的无机盐，接着用20～60％的乙醇水溶液作为洗脱液进行洗脱处理；(3)超滤分离：将步骤(2)中的洗脱液富集，浓缩后采用截留分子量为1～100KDa的超滤膜进行分离；(4)色谱分离：收集步骤(3)中的透过液，经过SephadexG-10型葡聚糖凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，洗脱速度为0.4～0.6mL/min，洗脱峰在220nm下进行测量；(5)再次分离：富集步骤(4)中的高活性洗脱液，利用半制备RP-HPLC反相高效液相色谱进一步分离，RP-HPLC的分离条件是用8～12％(v/v)的乙腈水溶液作为洗脱液，流速为1.5～2.5mL/min；(6)收集步骤(5)中得到的高活性洗脱液，冷冻干燥，得到羊胎盘抗氧化多肽。优选地，上述步骤(1)中的羊胎盘下脚料为提取天然羊胎盘肽过程中低温离心所得残渣，即为将羊胎盘匀浆、反复冻融、冷冻离心后所得沉淀残渣；酶解条件为：底物质量浓度为15～50mg/mL、pH为6.0～8.0、酶解温度为40～60℃、加酶量为2000～6000U/g、酶解时间为50～150min；更优选地，上述酶解条件为：底物质量浓度为33mg/mL、pH为6.5、酶解温度为55℃、加酶量为5000U/g、酶解时间为120min。优选地，上述步骤(2)中大孔吸附树脂为DA201-B型、DA201-C型或者DA201-D型大孔吸附树脂，更优选地，为DA201-C型大孔吸附树脂，所述洗脱液为50％的乙醇水溶液，流速为3mL/min。优选地，上述步骤(3)中超滤膜的截留分子量为1KDa，超滤条件：压力为0.3MPa、pH为7、温度为25℃。优选地，上述步骤(5)中富集高活性洗脱液为富集SephadexG-10型葡聚糖凝胶色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分。优选地，上述步骤(6)中收集高活性洗脱液为收集半制备RP-HPLC反相高效液相色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分。另一方面，本专利技术还提供了采用上述制备方法制备得到的羊胎盘抗氧化多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，具体为：谷氨酸-脯氨酸-缬氨酸-丝氨酸-组氨酸-苯丙氨酸(Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe)。此外，本专利技术还提供了上述羊胎盘抗氧化多肽在制备具有抗衰老功效的化妆品方面的应用，所述化妆品为乳液、晚霜、眼霜、凝露、精华素、面膜等。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.目前绝大多数对羊胎盘的利用仅限于羊胎盘本身，剩余的残渣直接被丢弃，没有得到充分的利用；而本专利技术选择羊胎盘加工之后的下脚料作为原料，对常规的废弃资源进行了二次回收利用，大大提高了产品的附加值，具有极大的环保意义。2.本专利技术在酶解制备抗氧化多肽的工艺过程中，从原料的选择与处理、酶解条件的优化调整、分离纯化条件的联合使用等多个方面进行了极为细致地研究，采用大孔吸附树脂、超滤膜、葡聚糖凝胶色谱分离以及RP-HPLC分离，将上述各技术手段耦合使用，步步密切相关，共同作为一个有机整体发挥高效地分离纯化的作用，从而获得纯度高、活性好的优质产物。3.通过活性肽数据库BIOPEP检索发现，采用本专利技术的制备方法获得的羊胎盘多肽(氨基酸序列为：Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe)，是一种新发现的肽。其中的谷氨酸Glu是酸性氨基酸，其羧基可供电子，有清除自由基及铁离子还原能力；组氨酸His含有咪唑基团可以参与氢原子和单电子转移反应，从而可中和或清除自由基、抑制活性氧、清除羟基自由基并螯合金属离子；苯丙氨酸Phe为芳香族氨基酸，通过共轭作用维持自由基的稳定；脯氨酸Pro和缬氨酸Val都有一定的抗氧化性能。多种抗氧化性氨基酸存在于一个多肽中有协同作用发挥更高的抗氧化性能。抗氧化肽的抗氧化活性与分子量大小、氨基酸组成及疏水性有密切的关系，小分子多肽(分子量集中在500-5000)较易透过各种细胞和组织，充分与自由基或基质金属酶等接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊胎盘抗氧化多肽的酶解制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)原料选择与酶解：选择羊胎盘下脚料为原料，采用木瓜蛋白酶对其进行酶解；(2)除糖脱盐处理：将步骤(1)中获得的酶解产物通过大孔吸附树脂，选择20～60％的乙醇水溶液作为洗脱液；(3)超滤分离：将步骤(2)中的洗脱液富集，浓缩后采用截留分子量为1～100KDa的超滤膜进行分离；(4)色谱分离：收集步骤(3)中的透过液，经过Sephadex G‑10型葡聚糖凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，洗脱速度为0.4～0.6mL/min，洗脱峰在220nm下进行测量；(5)再次分离：富集步骤(4)中的高活性洗脱液，利用半制备RP‑HPLC反相高效液相色谱进一步分离，选择8～12％的乙腈水溶液作为洗脱液，流速为1.5～2.5mL/min；(6)收集步骤(5)中得到的高活性洗脱液，冷冻干燥，得到羊胎盘抗氧化多肽。

【技术特征摘要】
1.一种羊胎盘抗氧化多肽的酶解制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)原料选择与酶解：选择羊胎盘下脚料为原料，采用木瓜蛋白酶对其进行酶解；(2)除糖脱盐处理：将步骤(1)中获得的酶解产物通过大孔吸附树脂，选择20～60％的乙醇水溶液作为洗脱液；(3)超滤分离：将步骤(2)中的洗脱液富集，浓缩后采用截留分子量为1～100KDa的超滤膜进行分离；(4)色谱分离：收集步骤(3)中的透过液，经过SephadexG-10型葡聚糖凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，洗脱速度为0.4～0.6mL/min，洗脱峰在220nm下进行测量；(5)再次分离：富集步骤(4)中的高活性洗脱液，利用半制备RP-HPLC反相高效液相色谱进一步分离，选择8～12％的乙腈水溶液作为洗脱液，流速为1.5～2.5mL/min；(6)收集步骤(5)中得到的高活性洗脱液，冷冻干燥，得到羊胎盘抗氧化多肽。2.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的羊胎盘下脚料为提取天然羊胎盘肽过程中低温离心所得残渣，即为将羊胎盘匀浆、反复冻融、冷冻离心后所得沉淀残渣。3.根据权利要求1所述的酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的酶解条件为：底物质量浓度为15～50mg/mL、pH为6.0～8.0、酶解温度为40～60℃、加酶量...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，曹光群，杨成，姜惠敏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32