固体生物团的空间分子分布谱生成和分布谱储存制造技术

本申请公开了一种用于捕获由生物材料形成的生物物质的空间分子分布谱的方法，所述方法包括以下步骤：a) 提供横切的生物团，例如肿瘤，所述横截面暴露所述团的至少一部分；b) 提供其面积至少等于所述团的所述部分的面积的固体载体；c) 将生物材料从所述团的该部分转移至所述载体，以在所述载体上提供存在于所述团的该部分的生物材料的二维印迹；和d) 实施从印迹的不同的预定的位置转移的生物材料的生物测定，以确定所述团的该部分的空间分子分布谱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及生物团(例如肿瘤)的离体空间分子分布谱生成和这样的分布谱的储存。专利技术背景本文中‘空间分子分布谱生成’指在分子或大分子水平上确定生物材料的组成。本文中大分子包括基因组、RNA表达、蛋白质组和酶信息。本专利技术人认为生物肿瘤以及其它生物团(例如细胞构造)的空间分子分布谱生成对于测定基因和蛋白质表达的模式是必要的，该基因和蛋白质表达模式导致表征不同的细胞类型（例如在实体肿瘤中）的生物变化，所述实体肿瘤例如但不限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌和和结肠直肠癌。然而，由于肿瘤的固有的生物异质性，肿瘤的分子分布谱生成非常复杂。对于以‘空间-分子图’横跨肿瘤和周围的细胞外基质二者允许分析多个生物标记的技术的需求日益增加。在实施方案中，本专利技术将能够鉴定肿瘤区域-特异性基因表达和基因重排分布谱，和蛋白质表达分布谱，这将对肿瘤异质性提供重要的信息并且将促进治疗和临床决定，预后预测和基础肿瘤生物学研究。恶性肿瘤的分子分布谱生成对于测定适当的肿瘤-特异性治疗方案和预测预后是必要的。特别重要的是分析表征侵袭性肿瘤的分子标记物，因为非常常见的是，由癌症引起的死亡率不是由原发性肿瘤而是由在其它器官中产生的继发性肿瘤(转移)引起。这样的分子标记物包括涉及上皮至间充质过渡(EMT)的那些，其为导致非侵袭性上皮细胞获得更多间充质表型因此在其性质上变得越来越具有侵袭性的过程。目前，用于肿瘤的分子分布谱生成的方法包括由本体肿瘤样品表达大量基因的微观阵列分析，这可能昂贵并且耗时。由于肿瘤具有固有的生物异质性因此存在非常不同的基因表达分布谱(所述表达分布谱取决于取了本体样品的哪部分)的事实，分子分布谱生成进一步复杂化。当前，在临床和研究背景下，将本体肿瘤样品储存在福尔马林固定的石蜡嵌入的(FFPE)块中。该储存方法不被广泛采用，因为由这些块分离的核酸通常被降解并且比来自非固定的组织分离的核酸含有更多的PCR抑制剂。此外，储存大量样品所需的物理空间通常不可得。此外，由于二维(2D)肿瘤结构可能丧失，通常不能容易地分析横跨肿瘤的特异性基因表达模式。当试图分析侵袭的分子标记物(例如涉及EMT的那些)时，这尤其是有问题的，所述侵袭分子标志物主要仅在肿瘤的边缘或侵袭前缘差异性表达(KahlertC，LahesS等人，OverexpressionofZEB2attheinvasionfrontofcolorectalcancerisanindependentprognosticmarkerandregulatestumourinvasioninvitro(在结肠直肠癌的侵袭前缘处ZEB2的过表达为独立的预后标记物并且体外调节肿瘤侵袭)。Clin.CancerRes.2011；17，24:7654-7663.；UsamiY，SatakeS等人，Snail-associatedepithelial-mesenchymaltransitionpromotesoesophagealsquamouscellcarcinomamotilityandprogression(Snail-相关的上皮-间充质过渡促进食管鳞状细胞癌运动性和进展)。JPathol.2008；215,3,330-339.)。先前的研究检查使用以商品名FTA®销售的固体载体纸来收集和分离由结肠直肠肿瘤样品收集的DNA，用于基于实时PCR的KRAS测定(PetrasML，LeffertsJA等人，KRASdetectionincolonictumoursbyDNAextractionfromFTAPaper:Themoleculartouch-prep(通过从FTA纸提取DNA检测结肠肿瘤中的KRAS：分子接触-制备)。DiagnMolPathol.2011；20,4:189-193)。在将FTA纸直接施用于切割表面之前，通过肿瘤取切片，收集来自结肠肿瘤的DNA。对由这些样品和由匹配的FFPE块提取的DNA进行KRAS突变分析。结果证明在两种DNA收集方法之间100%关联，并且突显出使用纸载体成功地储存肿瘤样品用于将来核酸分离和下游分析的可行性。然而，仅分析了一个基因组突变，并且研究未实施二维肿瘤基因表达分布谱或考虑其它分析物，例如酶。鉴于该背景，需要高品质核酸、蛋白质和酶储存系统，其可能在‘库’等中储存一段时间后，能够询问2D肿瘤结构，从而允许进行在空间上相关的下游基因表达分析等。本专利技术人已认识到，需要肿瘤分子分布谱生成的方法和试剂盒，其将允许肿瘤细胞和其它生物标记物，例如mRNA和蛋白质，包括酶蛋白质从组织表面直接转移到合适的固体载体上，用于在其原始2D空间背景下储存，例如使用经清洁剂处理的纸，例如FTA，允许长期储存。当需要时，可随后从肿瘤印迹的纸载体的任何区域取样品(例如从纸打孔得到的样品)，用于对于肿瘤的该区域特异的下游分子分析。本专利技术提供一种根据权利要求1的方法，其具有通过从属于权利要求1的权利要求所限定的优选的特征。本专利技术还提供通过权利要求限定的装置，其具有通过其从属的权利要求所限定的优选的特征。本专利技术延伸至试剂盒，所述试剂盒包括干燥的试剂组，例如呈容易可用的珠粒形式，其含有用以分析特异性基因表达信号的引物。所述方法将特别可用于鉴定与侵袭相关的基因的差异表达，其通常仅在肿瘤的侵袭性前缘处差异性表达，因此在本体肿瘤分析中鉴定不出。试剂盒可用于临床前肿瘤生物学研究和临床样品的分析二者。本专利技术延伸至使用未经处理的纸和基于下游蛋白质的测定的蛋白质表达分布谱生成，并且本公开先前还未在别的地方报道过。本专利技术将包括产品、方法和试剂盒权利要求。本专利技术延伸至本文公开的特征的任何组合，无论这样的组合是否在本文中明确提及了。此外，当两个或更多个特征组合提及时，在不扩展本专利技术的范围的情况下，意图可单独要求保护这样的特征。附图简述本专利技术可采用众多方式实施，下面参考附图来描述其说明性实施方案，其中：图1显示固定肿瘤横截面的托盘的平面图；图2显示包括在图1中显示的肿瘤的印迹的固体载体；图3显示在图1中显示的肿瘤的图像；图4显示扩增子的实验图像；和图5-12以图的形式显示实验数据。专利技术详述结合附图，通过参考以下描述，可以更好地理解本专利技术以及其目的和优点，其中在图中相同的参考数字识别相同的元件。参考图1，示意性显示了固定在夹具10中的癌性肿瘤的横截面T，在该实施方案中其为尺寸与以下描述的装置相容的托盘。横截面T为平躺在托盘10中的肿瘤的平行的切片。托盘10具有基底11，该基底包括直立钉12形式的固定工具，所述直立钉进而将肿瘤切片固定在适当的位置。在该说明中，在肿瘤20的外部区域(包括边缘部分22)的细胞类型用单阴影线描述，而在肿瘤的内部区域24的细胞类型表现为具有双阴影线。应认识到，肿瘤通常在具有复杂异质性的内部区域和边缘部分细胞类型之间具有限定不足或随机过渡，而不是如在图1中示意性说明的清楚的轮廓。参考图2，显示FTA®纸载体30，在其上紧贴在托盘10中安装（aFTA®papersupport30isshownontowhichfitssnuglyintothetray10）。图1的夹具10具有构造，即托盘侧面，用于引导载体30与横截面T接触。载体30可用衬里层或垫(不可见)支撑，其防止纸在使用时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于捕获由生物材料形成的生物团的空间分子分布谱的方法，所述方法包括以下步骤：a) 提供横切的生物团，例如肿瘤，所述横截面暴露所述团的至少一部分；b) 提供其面积至少等于该团的所述部分的面积的固体载体；c) 将生物材料从该团的该部分转移至所述载体，以在所述载体上提供存在于该团的该部分的生物材料的二维印迹；d) 实施从所述印迹的不同的预定的位置转移的生物材料的多于一次的生物测定，以确定所述团的该部分的空间分子分布谱。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.30 GB 1411624.81.一种用于捕获由生物材料形成的生物团的空间分子分布谱的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供横切的生物团，例如肿瘤，所述横截面暴露所述团的至少一部分；b)提供其面积至少等于该团的所述部分的面积的固体载体；c)将生物材料从该团的该部分转移至所述载体，以在所述载体上提供存在于该团的该部分的生物材料的二维印迹；d)实施从所述印迹的不同的预定的位置转移的生物材料的多于一次的生物测定，以确定所述团的该部分的空间分子分布谱。2.权利要求1的方法，其中所述转移生物材料的步骤包括使所述部分与所述载体接触优选至少5秒。3.权利要求1或2的方法，其中，所述团的至少一部分包括所述团的边缘部分和任选的所述团的通常中心部分，从而所述印迹包括来自所述边缘部分的生物材料和任选也包括所述中心部分的生物材料。4.权利要求1、2或3中任一项的方法，其中所述多于一次测定包括：核酸扩增，例如PCR，逆转录酶PCR，实时定量PCR，等温扩增；酶检测；和/或蛋白质定量。5.前述权利要求中任一项的方法，所述方法包括确定在本文的表3中标注的一种或多种基因的存在的其它步骤。6.前述权利要求中任一项的方法，所述方法包括使所述横切的生物团成像的其它步骤。7.权利要求5的方法，所述方法包括在所述固体载体上提供参比格子，和在所述图像上叠加类似的格子的...

【专利技术属性】
技术研发人员：AM沃克菲尔德，JK霍尔顿，PJ塔特内尔，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团英国有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB