本发明专利技术公开了一种用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的分子标记物及其高通量检测方法。所述分子标记物由上下游引物和探针组成，上下游引物和探针的序列如SEQ ID NO:1‑74所示，其中SEQ ID NO:1，2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3为相应探针；SEQ ID NO:4，5为一对上下游引物，SEQ ID NO:6为探针；以此类推至SEQ ID NO:72，73为一对上下游引物，SEQ ID NO:74为探针；所有探针均在5’和3’端连接荧光报告基团和荧光淬灭基团。能够一次进行5184个定量PCR反应，快速高效地同时对216个样品进行粪便污染的检测，克服了以往低通量的缺陷，灵敏度和特异度高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，尤其涉及一种用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的分子标记物及其高通量检测方法。
技术介绍
日趋加剧的水污染，已对人类的生存安全构成重大威胁，成为人类健康、经济和社会可持续发展的重大障碍。水体微生物污染(包括寄生虫、病毒、致病菌)会引起多种传染病和寄生虫病，对水质安全和人体健康造成重要威胁。粪便污染是水体微生物污染的主要来源之一，不同物种的宿主粪便由于其肠道微生物的差异对水质污染有着不同程度的危害，区分和鉴别水体的粪便污染的来源及程度将有助于水体微生物污染源的监管，从而有利于水质安全的保障。传统的总大肠菌群、粪大肠菌群等粪便污染指示微生物由于其能够在自然环境中存活并繁殖，在各种动物的肠道中没有特异性等缺陷不能用于准确评估水体微生物污染状况，且不能分辨粪便污染的来源。微生物源示踪技术的出现解决了这一难题，微生物源示踪技术是一种利用不同物种宿主的肠道微生物的差别追溯粪便污染来源的方法。目前进行微生物源示踪的方法有培养法、重复序列扩增法、分子杂交技术、实时荧光定量PCR法等。其中，TaqMan探针定量PCR方法基于特定的基因在不同物种宿主中存在差异，样品只有在拥有宿主特异的基因的情况下才能够被扩增，并且其能够实时检测出该基因的原始量，从而进行粪便污染来源的追溯和定量。基于TaqMan探针的荧光定量PCR方法进行微生物源示踪技术具有准确度高、灵敏度及特异性强的特点，可同时对目标微生物标记物进行定性和定量检测，是近年来较为广泛应用的微生物源示踪技术。虽然目前利用TaqMan探针定量PCR方法进行微生物源示踪已取得可喜的进展，然而由于技术和工作量的限制，以往研究往往只针对一种或少数几种分子标记物对一种或少数几种粪便污染源的检测，这就低估了许多没有进行检测的宿主粪便与分子标记物之间可能存在的交叉反应，且环境样品通常具有复合污染的特征，因此难以准确的对多种粪便污染进行溯源；其次，研究表明粪便宿主肠道微生物具有较明显的地域分布并受到饮食结构的影响，使得宿主特异分子标记物的使用有一定的地域局限性，用于某些地区灵敏度和特异度均较高的分子标记物并不能在其他地区很好地应用，因此有必要使用多种分子标记物提高粪便污染源检测结果的准确性；最后，粪便污染的溯源通常需要对某一区域的大量样品进行检测，常用的荧光定量PCR法由于通量的限制难以实现对多种分子标记物、大量样品的快速检测。
技术实现思路
针对以上不足，本专利技术开发一种高通量、能够加载多个分子标记物、对多种宿主来源复合粪便污染进行微生物源示踪的更准确分析的方法。为实现上述目的，本专利技术提供一种用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物由上下游引物和探针组成，所述上下游引物和探针的序列如SEQIDNO:1-74所示，其中SEQIDNO:1，2为一对上下游引物，SEQIDNO:3为相应探针；SEQIDNO:4，5为一对上下游引物，SEQIDNO:6为探针；以此类推至SEQIDNO:72，73为一对上下游引物，SEQIDNO:74为探针；所有探针均在5’和3’端连接荧光报告基团和荧光淬灭基团。进一步，所述探针的5’端均连接FAM荧光报告基团；SEQIDNO：3，SEQIDNO：9，SEQIDNO：15，SEQIDNO：21，SEQIDNO：30，SEQIDNO：33，SEQIDNO：36，SEQIDNO：39，SEQIDNO：42，SEQIDNO：48和SEQIDNO：57的3’端连接BHQ1荧光淬灭基团；SEQIDNO：6，SEQIDNO：12，SEQIDNO：18，SEQIDNO：24，SEQIDNO：27，SEQIDNO：45，SEQIDNO：51，SEQIDNO：54，SEQIDNO：60，SEQIDNO：63，SEQIDNO：66，SEQIDNO：71和SEQIDNO：74的3’端连接MGB-NFQ荧光淬灭基团。本专利技术还提供一种用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的芯片，其特征在于，含有所述的用于微生物源示踪的分子标记物。本专利技术还提供一种用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的高通量检测方法，其特征在于，使用了所述的用于微生物源示踪的分子标记物或所述用于微生物源示踪的芯片。进一步，其粪便污染宿主来源为人类、猪、牛、反刍动物、家禽、鸭、狗、马和猫中的至少一种。进一步，步骤为，样品DNA提取；高通量定量PCR：使用所述的用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的分子标记物所述用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的芯片；结果与数据分析。进一步，所述高通量定量PCR的反应体系为100nL，包含GeneExpressionMasterMix、1×ROX参比染料、1mg/mL牛血清白蛋白溶液、0.9μmol/L正向引物与反向引物、0.25μmol/L探针、20-50ng/μLDNA和无核酸酶灭菌水；扩增程序为50℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。表1即为芯片分子标记物序列信息表。表1芯片分子标记物序列信息表注：表格探针的“-”表示直接相连，为避免混淆，用“-”表示。其中SEQIDNO:1所示序列为5’CGTCAGGTTTGTTTCGGTATTG3’；SEQIDNO:2所示序列为5’TCATCACGTAACTTATTTATATGCATTAGC3’；SEQIDNO:3所示序列为5’TATCGAAAATCTCACGGATTAACTCTTGTGTACGC3’；SEQIDNO:4所示序列为5’GGCGGTCTTCCGGGTAAA3’；SEQIDNO:5所示序列为5’CACACTTCTGCGGGTCTTTGT3’；SEQIDNO:6所示序列为5’TGGCCGACTGCTC3’；SEQIDNO:7所示序列为5’ATCATGAGTTCACATGTCCG3’；SEQIDNO:8所示序列为5’CGTAGGAGTTTGGACCGTGT3’；SEQIDNO:9所示序列为5’CTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGA3’；SEQIDNO:10所示序列为5’ATCATGAGTTCACATGTCCG3’；SEQIDNO:11所示序列为5’CTTCCTCTCAGAACCCCTATCC3’；SEQIDNO:12所示序列为5’CTAATGGAACGCATCCC3’；SEQIDNO:13所示序列为5’AGTCCCACCCTCACACGATTCTTT3’；SEQIDNO:14所示序列为5’AGTAAGCCGAGGGCGTCTTTGATT3’；SEQIDNO:15所示序列为5’ACCCTTCATTATTGCAGCCCTAGCAGCACT3’；SEQIDNO:16所示序列为5’GCATGAATTTAGCTTGCTAAATTTGAT3’；SEQIDNO:17所示序列为5’ACCTCATACGGTATTAATCCGC3’；SEQIDNO:18所示序列为5’TCCACGGGATAGCC3’；SEQIDNO:19所示序列为5’ACAGCTGCACTACAAGCAATGC3’；SEQIDNO:20所示序列为5’GGATGTAGTCCGAATTGAGCTGATTAT3’；SEQIDNO:21所示序列为5’CATCGGAGACATTGG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物由上下游引物和探针组成，所述上下游引物和探针的序列如SEQ ID NO:1‑74所示，其中SEQ ID NO:1，2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3为相应探针；SEQ ID NO:4，5为一对上下游引物，SEQ ID NO:6为探针；以此类推至SEQ ID NO:72，73为一对上下游引物，SEQ ID NO:74为探针；所有探针均在5’和3’端连接荧光报告基团和荧光淬灭基团。
【技术特征摘要】
1.一种用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的分子标记物，其特征在于，所述分子标记物由上下游引物和探针组成，所述上下游引物和探针的序列如SEQIDNO:1-74所示，其中SEQIDNO:1，2为一对上下游引物，SEQIDNO:3为相应探针；SEQIDNO:4，5为一对上下游引物，SEQIDNO:6为探针；以此类推至SEQIDNO:72，73为一对上下游引物，SEQIDNO:74为探针；所有探针均在5’和3’端连接荧光报告基团和荧光淬灭基团。2.权利要求1所述用于多种粪便污染源检测的微生物源示踪的分子标记物，其特征在于，所述探针的5’端均连接FAM荧光报告基团；SEQIDNO：3，SEQIDNO：9，SEQIDNO：15，SEQIDNO：21，SEQIDNO：30，SEQIDNO：33，SEQIDNO：36，SEQIDNO：39，SEQIDNO：42，SEQIDNO：48和SEQIDNO：57的3’端连接BHQ1荧光淬灭基团；SEQIDNO：6，SEQIDNO：12，SEQIDNO：18，SEQIDNO：24，SEQIDNO：27，SEQIDNO：45，SEQIDNO：51，SEQIDNO：54，SEQIDNO：60，SEQIDNO：63，SEQIDNO：66，SEQIDNO：71和SEQIDNO：74的3’端连接MGB-NFQ荧光淬灭基团。3...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏建强，庄芳芳，朱永官，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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