一种检测水稻种子携带真菌的培养基制造技术

本发明专利技术公开一种检测水稻种子携带真菌的培养基。该培养基每升灭菌水中含有蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，MgSO4·7H2O 0.25g，琼脂15g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，硫酸铜0.05g，硝酸锌0.029g，尸胺0.0001g。该培养基是孟加拉红培养基的改进，通过本发明专利技术培养基可以更多地检测出水稻种子携带真菌，操作简便不易被细菌污染，真菌菌落的直径小于现有技术使用PDA培养基培养的真菌菌落直径，从而便于真菌的分离、统计。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于种子质量检测
，具体涉及对孟加拉红培养基进行改进用于检测水稻种子携带的真菌。
技术介绍
目前，种子健康度检测在很多国家已成为种子“质量评估”、“植物检疫”过程中的例行措施，已成为种子质量控制体系中不可或缺的组成部分，有些国家建立了专门的种子健康测定实验室。种子健康测定是测定种子是否携带有病原菌(如真菌、细菌及病毒)、有害的动物(如线虫及害虫)等健康状况，即对种子所携带病虫害种类及数量进行检测，其中种子携带真菌的检测是种子健康度检测中的重要内容。如国际水稻所自1983年成立种子健康部(SEEDHEALTHUNIT)及1987年建成种子健康试验室以来，开始了对种子健康的系统研究。传统的检测种子携带真菌的方法有洗涤法、琼脂皿法、滤纸保湿法。洗涤法：将种子放入已灭菌的250mL三角瓶中，然后加入灭菌水25mL，将三角瓶封口后置于转速为150rpm，25℃的摇床中充分震荡1h，收集悬浮液于已灭菌的10mL离心管中，以3000rpm的转速离心10min，去上清液后加入200μL无菌水悬浮沉淀。将悬浮液用灭菌水进行10倍系列浓度梯度稀释，然后涂PDA平板进行检测。洗涤法仅能对种子表面携带的部分真菌进行分离，对于已侵染进入种子内部的真菌无法分离，而且需要稀释洗涤液，需要多次试验才能较为完整的统计出种子表面携带的真菌种类和数量。保湿滤纸法：先用5％的次氯酸钠(NaClO)对供试种子进行表面消毒，然后用灭菌水清洗3次，消毒后的种子用滤纸吸干表面水分，置于垫有灭菌滤纸的9cm培养皿中，每个培养皿中叠放两层灭菌滤纸，用灭菌水湿润灭菌滤纸，种子摆放于湿润的灭菌滤纸后，在25℃恒温箱中光照(6h)/黑暗(6h)交替培养条件下培养12h，再置于-20℃冰箱中保持12h，使吸胀的种子死亡从而抑制种子发芽，而后置于25℃恒温箱中光照(12h)/黑暗(12h)培养5d后进行检测。保湿滤纸法可以避免细菌对真菌分离的干扰，但由于真菌生长的营养条件仅为种子供给，多个真菌在同一粒种子上着生时，难以单独分离。琼脂皿法是我国国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子—其它项目检验中规定的对种子携带的真菌进行分离检查方法。目前，我国对种子携带真菌的检测，基本采用国家标准GB/T3543.7-1995中的琼脂皿法。国家标准GB/T3543.7-1995规定的琼脂皿法：取适量种子在5％的次氯酸钠溶液中浸泡8min进行表面消毒，然后用无菌水冲洗3遍，晾干后均匀摆放在9cm直径PDA平板上，每皿摆放10粒，每个处理4次重复，相同操作下用空白的PDA平板作为环境对照(PDA平板在制作时需要添加适量的链霉素抑制细菌生长)。置于25℃温箱中12h光照/黑暗交替下培养6d后检查，记录种子以及不同解剖部位携带的真菌种类和数量。琼脂皿法虽然能较好的分离种子携带的真菌，但在分离时由于细菌的干扰，常常不能够很顺利的将真菌分离出来，而且有部分真菌生长速度较快，如青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、腐霉属(Pythium)、根霉属(Rhizopus)的真菌在培养6d后，单个菌落直径为4cm～5cm，甚至长满全皿，对其它真菌的分离造成干扰。真菌由于可以产生分生孢子，分生孢子随气流、水流等传播速度快，种子携带的真菌对农业生产的危害巨大，一旦发病后难以防治，如水稻稻瘟病菌可由种子携带，发病后会对生产造成毁灭性的灾害，因此研发一种能更多分离检测出种子携带的真菌方法，对于检测种子带真菌情况，预防毁灭性病害的发生具有重要意义。孟加拉红培养基的配方是蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂15g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g。孟加拉红培养基主要用于霉菌(Molds)和酵母菌(Yeast)的计数、分离和培养。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服种子健康检测的现有技术中存在分离真菌易受细菌干扰，以致分离的真菌数量少，不能完全反应种子所携带的真菌，以及分离时，部分真菌生长速度较快，菌落直径较长，对其它真菌的分离造成干扰、难以单独分离真菌的缺陷。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测水稻种子携带真菌的培养基，该培养基是在孟加拉红培养基的基础上进行的改进。本专利技术提供一种检测水稻种子携带真菌的培养基的配方是：每升灭菌水中加入蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，MgSO4·7H2O0.25g，琼脂15g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，硫酸铜0.05g，硝酸锌0.029g，尸胺0.0001g。本专利技术所述的一种检测水稻种子携带真菌的培养基的制备方法是：按上述一种检测水稻种子携带真菌的培养基的配方取各成分置于三角瓶中，再加入水1L，按湿热灭菌法，在121℃，0.1MPa～0.15MPa，湿热灭菌20min后，将三角瓶置于药品柜中保存，或分装入9cm直径培养皿内备用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术培养基在原孟加拉红培养基的基础上增加了硫酸铜(CuSO4)0.05g，硝酸锌(Zn(NO3)2)0.029g，尸胺(1,5-Pentanediamine)0.0001g，减少了硫酸镁(MgSO4)的用量，分离的真菌种类增加，在种子批相同的条件下，传统平皿法使用孟加拉红培养基在大多数情况下只能分离到青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、腐霉属(Pythium)、镰孢属(Fusarium)的真菌，本专利技术改进培养基配方后，除上述真菌外可多分离到平脐蠕孢属(Bipolaris)、弯孢属(Curvularia)、多节孢属(Nodulisporium)的真菌。2、不易被细菌污染。现有技术国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验中琼脂皿法规定的PDA培养基在添加抗生素(常用的是硫酸链霉素)后，不能完全避免细菌的干扰，细菌一旦滋生后，会迅速将整个培养基表面占满，影响真菌的生长，而且即使勉强将真菌分离出来后，也因夹杂着细菌，需要进行多次纯化，增加了工作量和污染的几率，难以获得目标真菌的纯培养，在所有措施均按照上述国家标准操作的情况，一般的细菌污染率在5％～10％。而使用本专利技术培养基细菌污染率在4％以下。3、便于真菌的分离。现有技术国家标准GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程—其它项目检验规定使用的PDA培养基由于营养过剩，部分真菌如青霉菌、曲霉菌、镰孢属、腐霉等生长速度较快，菌落直径过大，培养6d以后，菌落直径为4cm～5cm，有的甚至长满全皿，难以有效挑取单个菌落进行鉴定分析。且抑制了其它真菌的生长，导致检测结果不准确，而使用本专利技术培养基后，由于培养基营养成分仅满足真菌生长的基本需要，培养6d后，真菌菌落的直径在2cm～3cm，小于现有技术使用PDA培养基培养的真菌菌落直径(4cm～5cm)，从而可以做到有效准确的分离。4、便于种子真菌携带率的统计。种子真菌携带率的统计是根据平皿培养的结果，对每粒种子上生长的菌落进行计数，并分别挑取进行鉴定，统计所有重复试验中带菌种子的数量、不同种类真菌的数量和菌落总数量。然后计算该批次种子的带菌率和不同种类真菌的出现频率，如检测到病原菌且出现频率较高，就需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测水稻种子携带真菌的培养基，其特征在于：每升灭菌水中加入蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，MgSO4·7H2O 0.25g，琼脂15g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，硫酸铜0.05g，硝酸锌0.029g，尸胺0.0001g。

【技术特征摘要】
1.一种检测水稻种子携带真菌的培养基，其特征在于：每升灭菌水中加入蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，MgSO4·7H...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小林，徐雨然，谷安宇，邓伟，张锦文，谭静，安华，
申请(专利权)人：云南霖鹏农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53