本发明专利技术公开了水稻细胞色素Ｐ４５０基因专用引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留。该引物是由序列表中序列１和序列２组成的。本发明专利技术公开的方法，是将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总ＲＮＡ反转录获得的ｃＤＮＡ为模板，用上述引物进行实时荧光定量ＰＣＲ扩增，通过扩增曲线计算待检测的植物培养基质中的水稻的总ＲＮＡ中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质中的水稻的总ＲＮＡ中特异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于２．０±０．０５，待测植物培养基质为有除草剂残留的候选植物培养基质。本发明专利技术的方法使对植物培养基质中除草剂残留的检测快速简便。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水稻细胞色素P450基因专用引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留。
技术介绍
利用生物技术发展生态农药是现代农业研究的一个重要方向，可以缓解农民负担、减少生态环境污染和降低因大量农药残留造成的人类健康危害。细胞色素P450酶系是结合在内质网膜上含硫醇血红素的氧化酶。细胞色素P450超基因家族存在很强的生物多样性，广泛参与动植物的各类生命活动，比如生物分子合成、解毒和药物代谢途径。利用功能基因组学和生物信息学手段，研究整合生物代谢途径中的细胞色素P450家族的功能信息，研究预测与降解农药残留相关的水稻P450基因，将有利于生产我国自主性的生态农药。以信号受体和转录途径组分分析为基础可进行农用化合物设计，结合化学信息学方法，可鉴定用于杀虫剂和除草剂的潜在化学成分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供水稻细胞色素P450基因专用引物辅助鉴别植物培养基质中除草剂的残留。本专利技术所提供的辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。该引物对是根据水稻细胞色素P450基因序列设计的，细胞色素P450基因命名为CYP81A6 ，其NCBI定位号为NP—001051342， NCBI基因号(GENE ID)为0s03g0760200， DBJ号为AK104825， TIGR号为L0C—0s03g55240，全长cDNA序列长度为2199个核苷酸，定位于第三号染色体从31，379,697bp到31， 384， 722bp，该基因编码的蛋白共有732氨基酸。CYP81A6基因的表达受除草剂的诱导，所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。本专利技术的另一个目的是提供一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法。本专利技术所提供的辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的方法，是将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中，以所述水稻的总RNA反转录获得的cDNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线计算待测的植物培养基质的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数与不含除草剂的植物培养基质的水稻的总RNA中特异性扩增产物的初始拷贝数的比值，所述比值大于2.0土0.05，待测植物培养基质为有除草剂残留的候选植物培养基质。所述的植物培养基质可为任何可培养植物的液体或固体基质，如培养液、土壤、蛭石等。当所述待测的植物培养基质为液体时，可将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待检测的植物培养基质中6小时-24小时；当所述待测的植物培养基质为固体时，可将待测的植物培养基质用5ml/100ml 二甲亚砜水溶液浸泡，收集浸出液；将在不含除草剂的植物培养基质中培养的水稻移栽到待测的植物培养基质中6小时-24小时。进行所述移栽的水稻可处于二叶期-四叶期。所述除草剂为二氯喹啉酸、苯达松、甲磺隆、异恶草酮或甲基紫精。通过本专利技术提供的辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法，可初步鉴定植物培养基质中是否有除草剂残留，再结合现有的仪器分析方法可确定植物培养基质中是否有除草剂残留。为了方便、快速辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留，本专利技术还提供了一种专用的荧光定量PCR试剂盒，该荧光定量PCR试剂盒包含一对引物，该引物对由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成。本专利技术根据一个对多种除草剂具有明显应答特征的水稻细胞色素P450基因的基因序列设计了一对引物，用该引物对可辅助检测植物培养基质中是否有除草剂残留。利用本专利技术的辅助鉴定植物培养基质中除草剂残留的方法可对植物培养基质进行初步筛査，将筛出的候选植物培养基质再用现有的仪器分析方法进行确定有无除草剂残留，可大大降低仪器分析的工作强度，使对植物培养基质中除草剂残留的检测快速简便。附图说明图1为水稻细胞色素P450基因，CYP81A6，在水稻基因组序列上的位置示意图及基因结构。图2为CYP81A6基因在二氯喹啉酸的处理条件下表达变化。图3为CYP81A6基因在多种除草剂的处理条件下表达变化。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。下述实施例中的水稻品种来自国家种质资源库。实施例1、 CYP81A6在基因组序列的定位及引物设计通过Blast分析，将已命名的水稻细胞色素P450基因和TIGR水稻数据库中的基因位点对应起来，CYP81A6对应L0C—0s03g55240，位于第三号染色体第31, 379， 697bp到31，384，722bp，具有五个外显子和四个内含子，该基因的结构如图l所示。根据CYP81A6的mRNA序列，用primer3工具，在CYP81A6的mRNA序列靠近3'端设计一对特异引物ChemR3-1和ChemR3-2，引物ChemR3-1和ChemR3-2的序列分别为序列表中的序列1和序列2。实施例2、用引物ChemR3-1和ChemR3-2检测CYP81A6在除草剂处理下的表达以5ml/100ml 二甲亚砜水溶液为溶剂分别配制浓度为1. 65mM 二氯喹啉酸溶液、浓度为19.98mM苯达松溶液、浓度为1.31raM甲磺隆溶液、浓度为1.75mM异恶草酮溶液和浓度为10yM甲基紫精溶液。在正常生长条件下(温度为28。C / 25°C ，相对湿度83%， 12小时昼夜循环)生长的水稻日本晴的幼苗，在两叶一心期分别用1.65mM二氯喹啉酸溶液、19.98mM苯达松溶液、1. 31mM甲磺隆溶液、1.75mM异恶草酮溶液和10uM甲基紫精溶液喷雾处理，以用5ml/100ml二甲亚砜水溶液喷雾处理作为对照，实验重复3次，每个重复处理10-20株水稻。提取1. 65mM 二氯喹啉酸溶液处理3小时、6小时和24小时及二甲亚砜处理3小时、6小时和24小时的水稻日本晴幼苗的总RNA，反转录成cDNA;以反转录cDNA为模板，ChemR3-1和ChemR3-2为引物通过实时荧光定量PCR技术检测CYP81A6的表达水平。取上述5种除草剂处理6小时的水稻日本晴幼苗和对照幼苗分别提取总RNA，反转录成cDNA;以反转录cDNA为模板，ChemR3-1和ChemR3-2为引物通过实时荧光定量PCR技术检测CYP81A6的表达水平。荧光定量PCR反应条件如下以18S rRNA作为内标，按下列条件进行实时荧光定量PCR反应，反应体系IO w L:10 XPCR Buffer 1 u L， 25mmol/L Mg2+ 1 y L， 10 mmol/L dNTPs 0. 5 u L， 25 u mol/L上下游引物各O. 25 uL， cDNA模板l u L， Taq酶(Promega) 0.25 n L， 20XSYBR GreenI 0. 5 u L， ddH20 6. 25 u L。检测CYP81A6的表达水平实时荧光定量PCR的反应条件95匸变性3 mi n，循环40次9 5 °C变性4 0 s — 6 1 °C退火2 5 s — 7 2 。C延伸l mi n 20 s，融解95。C 0 s(20°C/s)—71°C 15 s(20°C/s—95°C0 s(0.rC/s),冷却40。C 30 s(20°C/s)。所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种辅助鉴别植物培养基质中除草剂残留的引物，是由序列表中序列１的核苷酸序列和序列２的核苷酸序列组成的一对引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏震，徐文英，邸超，周少霞，张盖华，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[]
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