抗体处理方法技术

本发明专利技术提供了用于去除不需要的抗体聚集体和/或抗体二聚体和/或抗体前单体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产适合于治疗应用的高质量抗体的方法。
技术介绍
基于生物制品的新型免疫调节药物对于患有严重的慢性疾病例如各种类型的癌症和炎性疾病的许多患者而言代表了一种革命。许多生物药物是以抗体为基础的。因而在本领域中需要用于提供极高纯度的高质量治疗性抗体的方法。使用蛋白A亲和色谱法、离子交换色谱法和疏水作用色谱法纯化IgG是已知的(EP746398)。使用蛋白A色谱法从错误折叠的抗体种类中分离单体IgG也是已知的(US5429746)。由US5641870得知，使用具有极低pH(2.5-4.5)的缓冲液通过HIC纯化抗体适合于F(ab′)2抗体的纯化。关于一些抗体的纯化，可形成诸如抗体二聚体或高阶聚集体的抗体聚集体，并且在一些情况下，它们可能难以使用分析方法来分离。因而在本领域中需要用于去除抗体聚集体的改进方法。特别是，在本领域中需要用于提供来自细胞培养物的高质量(单体)抗体例如重组治疗性抗体的有效方法。
技术实现思路
本专利技术提供了优选地在(单体)抗体产率没有显著降低的情况下用于纯化/分离抗体的改进的方法，特别是用于从含有单体抗体的溶液中去除不需要的抗体聚集体和/或抗体二聚体和/或抗体前单体(pre-monomer)的方法。本专利技术涉及用于从重组抗体水溶液中去除不需要的抗体聚集体和/或抗体二聚体和/或抗体前单体的方法，其中所述方法包括使用疏水作用色谱法(HIC)纯化(单体)抗体的步骤。本专利技术还涉及由这样的方法产生的产物及其用途。说明本文所述的方法适合于从(单体)抗体水溶液中去除抗体聚集体和/或抗体二聚体和/或抗体前单体。优选地，本文所述的方法导致具有更高纯度和/或更均一的性质的重组治疗性抗体。特别是，本专利技术人已惊奇地发现，通过采用疏水作用色谱法纯化步骤可显著降低抗体聚集体和/或抗体二聚体和/或抗体前单体的水平。本文提供的方法对于从细胞培养物中纯化重组抗体的过程尤其有用。附图说明图1：显示各种抗IL-21化合物(单体和聚集体)的SEC-HPLC色谱图。图2：包含两条重链(HC)和三条轻链(LC)的抗体前单体杂质，其中一条轻链是非共价连接的(LC2HC2：LC)。基于LC2HC2：LC的生物物理学、光谱学和功能特征，提出了所示的分子结构，即这样一种抗体，其中额外的轻链占据了在正常情况下被HC占据的位置。该额外的LC仅仅经由非共价相互作用与另一LC结合，该另一LC又与HC共价结合。通过与谷胱甘肽或半胱氨酸形成二硫键，非共价连接的LC中的C末端半胱氨酸被加帽。图3：图3A和图3B显示了如实施例3中所述对来自抗体组分的两种HIC分离的洗脱液级分(eluatefraction)的分析。左侧刻度表示抗体含量，而右侧刻度表示抗体聚集体的相对量。首先洗脱出单体，然后是抗体制剂的前单体(hmwp3)和二聚体(hmwp2)组分。最后洗脱出更高阶的聚集体(hmwp1)。定义和序列信息“生物制品”：生物药物是在诸如微生物或植物或动物细胞等生命系统中制备的。大多数生物制品是大的复杂分子或分子的混合物。许多生物制品使用重组DNA技术产生。通过实验室中可用的测试方法表征复杂的生物药物可能是困难的，并且有时是不可能的，并且制成的生物药物的一些元素可能是未知的。抗体是生物药物的实例。“抗体”：如本文所用的术语“抗体”、“单克隆抗体”、“单体抗体”和“mAb”旨在表示具有与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子及其片段。本文使用单体和单体抗体来描述常规形式的抗体，例如由两条轻链和两条重链组成的抗体。本文的抗体优选地是重组抗体。全长抗体包含四条多肽链：通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域：CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，被称为互补决定区(CDR)，其中散布着被称为构架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端至羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可以为不同同种型的形式；例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgGA1、IgA2、IgD和IgE。全长抗体通常是二价的/双价的，即，它具有用两只“臂”结合抗原的能力。相反，单价抗体(例如Fab片段)仅包含一个对抗原具有特异性的结合位点。如本文所用的术语“人抗体”意指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。“人源化抗体”包含移植到人类骨架上的来自非人来源(例如小鼠)的CDR序列。“抗体聚集体”：聚集体是分子量不同于单体抗体的抗体或抗体部分的复合物。抗体聚集体的实例包括大聚集体，其包含3个或更多个非共价结合的抗体分子。就图1而言，这样的聚集体被称为HMWP1或更高阶的聚集体。抗体二聚体被称为HMWP2，并且表示两个非共价结合的抗体的复合物。本文所述的非传统聚集体被称为HMWP3或前单体，并且其被表征为抗体单体和非共价结合的轻链的复合物。“疏水作用色谱法(HIC)”是指依赖于物质对液体移动介质和对它们所通过的固定吸附介质如纸、明胶或氧化镁的差异亲和力来分离复杂混合物的各种技术。以含有附接至骨架的芳香疏水基团的材料为基础的固定柱材料，例如具有共价偶联的苯基基团的交联琼脂糖，是优选的。具有约2-15％、3-12％、4-10％、4-8％、5-7％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％交联的琼脂糖是优选的。特别优选的柱材料是以苯基琼脂糖(PhenylSepharose)或具有类似性质的材料为基础的，例如“PhenylSepharose6Fast(lowsub和highsub)”和“PhenylSepharoseHigh”以及PhenylSepharose它们均为GE-HealthCare.LifeScience的商标。“IL-21”是一种I型细胞因子.它对先天性和适应性免疫应答均发挥多效性作用。其主要由活化的CD4+T细胞、滤泡T细胞和自然杀伤细胞产生。此外，最近的证据表明，Th17细胞可以产生大量的IL-21。IL-21增加CD8+T细胞的细胞毒性，并且可以在抗原的存在下促进CD8+细胞的增殖。IL-21由IL-6诱导，IL-6是一种已知促进Th17细胞的发育的细胞因子。IL-21以自分泌方式作用于T辅助细胞，促进其自身的产生并支持T辅助细胞分化为Th17细胞。IL-21还作用于B细胞并增加抗体产量。IL-21增强免疫的能力已引起对IL-21的治疗用途的极大兴趣。动物研究已证明了在IL-21与肿瘤特异性抗体之间的协同作用，这可能提示了未来IL-21作为抗肿瘤抗体的增效剂的治疗用途。而且，IL-21在自身免疫病中发挥复杂的作用。IL-21促进Th17发育的能力使其成为促炎性细胞因子，并且目前正在研究IL-21抑制剂在治疗一系列不同的自身免疫病中的潜在用途。SEQIDNo1：hIL-21(包括横跨氨基酸1-29的信号肽-mAb5表位以粗体显示；IL-21R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从重组抗体水溶液中去除抗体前单体的方法，其中所述方法包括使用疏水作用色谱法(HIC)将前单体和任选的抗体二聚体与单体抗体分离的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.07 EP 14154266.21.一种用于从重组抗体水溶液中去除抗体前单体的方法，其中所述方法包括使用疏水作用色谱法(HIC)将前单体和任选的抗体二聚体与单体抗体分离的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：i)获得包含前单体组分的抗体制剂ii)将所述抗体制剂加载至疏水作用色谱(HIC)柱上iii)使抗体和前单体与柱材料结合iv)顺序洗脱所述制剂的抗体组分，和v)选择不包含(大量)前单体的洗脱液级分，从而获得单体抗体的组合物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在包含高含量的前单体的级分之前洗脱的级分中获得所述单体抗体。4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在包含大多数前单体和抗体二聚体的级分之前洗脱的级分中获得所述单体抗体。5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中通过在前单体和其他聚集体的累积量达到约1％时取消选择洗脱液级分来去除所述前单体。6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述抗体为IL-21抗体，诸如包含如SEQIDNO2所示的三个CDR序列和如SEQIDNO3所示的三个CDR序列的抗体。7.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述HIC柱材料具有50g抗体/L或更大的结合容量，并且/或者其中所述HIC柱材料包含4-8％含有共价偶联的苯基基团的交联琼脂糖，并且/或者其中所述HIC柱材料包含20-45μMol苯基基团/ml。8.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：在浓度为0.8-1.5mol/kg的硫酸铵的存在下将所述抗体加载到HIC柱上，随后用逐渐降低的硫酸铵梯度从HIC柱上洗脱所述抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：OE詹森，MS查德菲尔德，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK