微液滴反应编码检测方法及其系统技术方案

本发明专利技术提供一种微液滴反应编码检测方法及其系统。该编码检测方法包括将不同的试剂按顺序在微流控芯片管道中生成微液滴，并按照先后顺序排成一个队列；带有标记信息的微液滴成为标志液滴，其所在队列中的区域成为编码区；带有生化反应试剂的微液滴成为功能液滴，其所在队列中的区域称为功能区；每个功能区之间都间隔着一个编码区，由这种反应区加编码区的重复结构组成了完整的编码队列。本发明专利技术编码容量大，编码容量不受编码方法限制，编码物质和生化反应在空间上完全隔离，易于解码和解码鲁棒性高，并且易于集成芯片实验室。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微液滴生物医学检测领域，特别涉及微液滴反应编码检测方法及其系统。
技术介绍
液滴微流控技术是微流控芯技术的一个重要的组成部分，其特征是在微流道或毛细管中将两种不相容的流体形成微米尺度的液滴。生物医学检测领域中最常见的是“油包水”的液滴。其中，油作为将每个液滴相互隔离的载体。这种微米尺度的液滴也被作为微反应器。也就是说，一个直径几十微米的液滴可以看成是一个传统生化检测中使用的试管，同样可以在微液滴内进行生化反应和用于生物医学中目标分子的检测。相比于传统的试管，微液滴反应的优点包括：(1)微液滴的体积只有皮升级，相当于反应体积缩小了6个数量级。因此，微液滴反应所需的试剂量大大减少，反应成本大幅降低；(2)一次反应中使用的微液滴数量可以高达上千万个，这使得检测通量能够得到极大的提高；(3)由于微液滴体积小，其背景噪声也相应的得到了很大程度的降低，使得检测灵敏度能有很大的提升。因此，微液滴技术是一项很有前景的生化分析检测技术。基于微液滴的数字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一种基于单分子PCR方法来对核酸进行绝对精确定量的方法。其原理是将大量稀释后的核酸溶液分散至微液滴中，每个反应器的核酸模板数只有0个和1个两种情况。经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR不同，数字PCR通过直接计数的方法，可以实现起始核酸模板的绝对定量。在传统的多指标检测当中，每一个反应试管里进行一种特定反应。因而需要对每一个试管贴上特定的标签，以标识其管内的反应物。同理，一个微液滴就相当于一个反应试管，那么在多指标检测当中，也需要特殊的“标签”来识别和区分每一个微液滴内的反应物。给微液滴反应贴“标签”的技术，叫做微液滴的编码技术。高通量多指标检测对微液滴的编码技术提出了新的挑战。目前常用的微液滴编码方法包括以下三种：(1)基于颜色信息的微液滴编码方法。通过在不同的微液滴中加入不同颜色的染料，并通过检测其颜色信息来实现解码。基于颜色信息的微液滴编码方法具有编码直观和无需复杂的检测设备的优势，但是基于颜色信息的编码方法存在编码容量不高、编码染料影响生化反应效率等不足。(2)基于空间位置信息的微液滴编码方法。在已知空间位置的微结构加入已编号的生化反应信息的液滴，并通过检测其空间位置信息来实现解码。空间位置信息编码的方法具有解码方便、解码速度快等优点。但受到加工工艺和空间体积限制等因素限制，使其编码的容量容易受到限制。同时，在液滴加样环节，也存在一定的挑战，对加工工艺和检测设备都提出了更高的要求。(3)基于核酸序列的微液滴编码方法。在不同种类的微液滴内加入不同已知的特定核酸序列，并通过对核酸序列的测序来完成微液滴的解码。基于核酸序列的编码方法具有很高的编码容量，但是由于核酸序列测序需要比较复杂的过程，因而这种编码方式只适合一些特定的场合。由于现有方法编码能力的限制，目前多指标的数字PCR只能实现数个到十数个的不同位点的同步检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服前面所说的几种微液滴编码方法的不足，提出一种基于标志液滴的时序编码方法。在一种实施方式中，本专利技术提供一种微液滴反应编码检测方法，其特征在于包括以下步骤：不同的试剂按顺序在微流控芯片管道中生成微液滴，并按照先后顺序排成一个队列；带有标记信息的微液滴成为标志液滴，其所在队列中的区域成为编码区；带有生化反应试剂的微液滴成为功能液滴，其所在队列中的区域称为功能区；每个功能区之间都间隔着一个编码区，由这种反应区加编码区的重复结构组成了完整的编码队列；和当编码队列进入检测区时，根据进样的先后顺序以及各个编码区信息，解码每个功能区内包含的功能液滴所对应的反应物。在一种实施方式中，通过控制外部各个进样器例如注射器的工作顺序，实现不同的试剂按顺序在微流控芯片管道中生成微液滴。在一种实施方式中，进样器通过配件例如特氟龙卡具与芯片入口相连。在一种实施方式中，包括二个装载矿物油用于后续液滴生成的注射器，一个装载标志溶液用于生成标志液滴的注射器；和多个装载生化反应试剂用于生成功能液滴的注射器。在一种实施方式中，标志溶液和各个生化反应试剂按照进样顺序在微流控芯片内“十字”液滴生成区域与矿物油汇合，形成“油包水”的液滴。在一种实施方式中，在编码时通过控制标志液滴的荧光强度，使得标志液滴与功能液滴相区分。在一种实施方式中，在编码时通过控制标志液滴体积的不同，从而控制荧光信号持续时间的长短，使标志液滴与功能液滴相区分。在一种实施方式中，通过控制标志液滴的颜色，使其与功能液滴相区分。在一种实施方式中，通过控制标志液滴的吸光度的变化，使其与功能液滴相区分。在一种实施方式中，通过控制标志液滴的反射角度的变化，使其与功能液滴相区分。在一种实施方式中，标志液滴自身内部的排列组合产生特定顺序和意义，使其与功能液滴相区分。在一种实施方式中，提供一种在本专利技术的微液滴反应编码检测方法中应用的系统，所述系统包括进样区、液滴生成区、反应区和检测区。本专利技术的微液滴反应编码检测方法及其系统具有以下四个优点：(1)本专利技术具有编码容量大，编码容量不受编码方法限制的优点。普通的液滴编码方法，比如颜色和荧光强度编码方法，编码容量会受到检测系统对于编码特征的分辨能力的限制，比如对颜色差别或荧光强度差别的分辨能力限制，而存在编码能力的上限，限制了微液滴的实际应用。而本专利技术提供的编码方法，不受系统对编码特征的分辨能力的限制，理论上不存在编码容量的上限，这将使得微液滴的多指标分析能力大大增强。(2)本专利技术提供的编码方法，具有编码物质和生化反应在空间上完全隔离的优点。这使得编码物质不会对生化反应产生任何的影响，这对保证高灵敏度的生化检测反应能够正常进行尤为重要。(3)本专利技术提供的编码还具有易于解码和解码鲁棒性高的优点。由于液滴队列中标志液滴和功能液滴在空间上不互相混合，因而不需要同时解码编码信息和读取生化反应的信息，降低对系统读取和处理信息能力的要求。同时，由于液滴队列中各个功能区是相互分隔的，也就是含有不同的生化反应的液滴是被编码区所隔离，解码的时候就不容易发生对生化反应类别判读错误的情况，从而实现高的解码鲁棒性。(4)本专利技术提供的编码方法还具有易于集成芯片实验室的优点。由于编码方法要求液滴保持队列的形式，因此整个过程都是要求在封闭的管道内的，适合集成芯片实验室的特点。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是本专利技术的微液滴反应编码检测方法示意图；图2是本专利技术的微液滴反应编码检测系统示意图；图3是高荧光强度作为标志液滴特征的编码实现多位点的基因检测中经过PCR反应后的阳性液滴与阴性液滴的荧光信号；图4是高荧光强度作为标志液滴特征的编码实现多位点的基因检测中含有量子点的标志液滴的荧光信号；图5是具有高荧光强度为特征的标志液滴的编码原理示意图；图6是以不同体积作为标志液滴特征的编码方法示意图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微液滴反应编码检测方法，其特征在于包括以下步骤：不同的试剂按顺序在微流控芯片管道中生成微液滴，并按照先后顺序排成一个队列；带有标记信息的微液滴成为标志液滴，其所在队列中的区域成为编码区；带有生化反应试剂的微液滴成为功能液滴，其所在队列中的区域称为功能区；每个功能区之间都间隔着一个编码区，由这种反应区加编码区的重复结构组成了完整的编码队列；当编码队列进入检测区时，根据进样的先后顺序以及各个编码区信息，解码每个功能区内包含的功能液滴所对应的生化反应信息。

【技术特征摘要】
1.一种微液滴反应编码检测方法，其特征在于包括以下步骤：不同的试剂按顺序在微流控芯片管道中生成微液滴，并按照先后顺序排成一个队列；带有标记信息的微液滴成为标志液滴，其所在队列中的区域成为编码区；带有生化反应试剂的微液滴成为功能液滴，其所在队列中的区域称为功能区；每个功能区之间都间隔着一个编码区，由这种反应区加编码区的重复结构组成了完整的编码队列；当编码队列进入检测区时，根据进样的先后顺序以及各个编码区信息，解码每个功能区内包含的功能液滴所对应的生化反应信息。2.根据权利要求1的所述微液滴反应编码检测方法，其特征在于：通过控制外部各个进样器例如注射器的工作顺序，实现不同的反应试剂按顺序在微流控芯片管道中生成微液滴。3.根据权利要求2的所述微液滴反应编码检测方法，其特征在于：所述进样器通过配件例如特氟龙卡具与芯片入口相连。4.根据权利要求2的所述微液滴反应编码检测方法，其特征在于：包括二个装载矿物油用于后续液滴生成的进样器，一个装载标志溶液用于生成标志液滴的进样器；和多个装载生化反应试剂用于生成功能液滴的进样器。5.根据权利要求4的所述微液滴反应编码检测方法，其特征在于：标志溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏世圣，郭永，荆高山，王博，张妙琪，柳哲，高华方，祝令香，杨文军，王勇斗，
申请(专利权)人：清华大学，北京天健惠康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11