一种免疫增强剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及海洋生物技术领域，具体讲是一种免疫增强剂及其制备方法。免疫增强剂的有效成分为壳聚糖硫酸酯类化合物，其壳聚糖硫酸酯类化合物为β‑C‑2，3，6‑硫酸酯‑壳聚糖。其结构式如下，其中n为聚合度：4‑40；该化合物的活性基团—硫酸酯基(OSO3－)的含量为30‑35％。本发明专利技术化合物可显著增加NO及TNF‑α、COX‑2等多种细胞因子的表达，并从基因和蛋白水平进行了机理确定，该体外免疫增强活性，受活性基团硫酸酯基及其分子量的影响显著，有望开发成为一种新型免疫佐剂。其制备方法属均相反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋生物
，具体讲是一种免疫增强剂及其制备方法。
技术介绍
免疫增强剂通常指的是在单用或与抗原同时使用时可增强机体免疫应答的物质，亦被称为免疫调节剂或免疫刺激剂。免疫增强剂可通过不同的作用途径发挥作用，如增强巨噬细胞的活性、增强抗原物质的免疫原性和稳定性以及促进抗体的合成与分泌等，从而增强机体的特异性和非特异性免疫应答。随着免疫学研究的不断深入，开发高效、稳定、安全的免疫增强剂越来越受到人们的重视。巨噬细胞是调节机体固有免疫和适应性免疫反应重要的抗原递呈细胞，在宿主对病原菌感染的防御系统中扮演着重要角色，被刺激后可产生不同的炎性介质、细胞因子等，从而抵抗病原菌。因而本专利技术以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，测量NO表达量，并从mRNA和蛋白表达水平上测定iNOS、TNF-α、COX-2等细胞因子的表达量，为β-壳聚糖硫酸酯作为免疫增强剂的应用提供参考依据。甲壳素是世界第二大纤维素资源，由于来源不同，其构型可分为α-甲壳素、β-甲壳素、γ-甲壳素，目前研究最多的为α-甲壳素，为反平行结构，其次为β-甲壳素，为平行结构，不同构型的甲壳素可能显示不同的功效。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰得到的产物，其生物相容性好，但由于其难溶于水和大部分有机溶剂而限制了其应用；而本专利技术所用的衍生物壳聚糖硫酸酯除了具有以上优点外还具有良好的水溶性，因而应用更加方便。本专利技术制备了不同分子量β-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯，并以小鼠腹腔巨噬细胞为模型，测定其免疫指标及机理，从而为开发新的免疫增强剂提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种免疫增强剂及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种免疫增强剂，免疫增强剂的有效成分为壳聚糖硫酸酯类化合物；其壳聚糖硫酸酯类化合物为不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。所述不同分子量的β-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯有效剂量为50-200μg/mL。所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖，其结构式为：其中n为聚合度：4-40；该化合物的活性基团—硫酸酯基(OSO3－)的含量为30-35％。所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：(1)磺化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌条件下滴加氯磺酸，使其在0-5℃反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5：1)-(10：1)；(2)不同分子量的β-壳聚糖的制备：将高分子量β-壳聚糖溶于过量的酸性溶液中，而后再加入双氧水(使溶液中H2O2最终体积分数为3％)，混匀后于60-80℃水浴搅拌10-60分钟，得到不同分子量的β-壳聚糖；(3)β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：称取上述获得的不同分子量的β-壳聚糖，加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后，再加入上述磺化试剂，混合均匀后，于微波降解反应器中，在微波辐射40-70℃条件下，40-70℃反应，反应后纯化后得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖；其中，β-壳聚糖、甲酸或二氯乙酸、N,N-二甲基甲酰胺按质量体积比为1:1-2.5：20-25(g：ml：ml)；β-壳聚糖与磺化试剂按质量体积比为1：15-25(g：ml)。所述高分子量β-壳聚糖的分子量为2000kDa-4573kDa。其，来源于鱿鱼软骨、墨鱼软骨等材料。所述步骤(2)酸性溶液为浓度为1-3％甲酸、乙酸或盐酸。所述步骤(3)将分子量低于10KDa的壳聚糖原料，在40-45℃的微波辅助条件下反应1-3分钟，得到1000-4000Da分子量的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯；将分子量在10-100KDa的壳聚糖原料，在45-55℃的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到4.5-10KDa的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯；将分子量在100KDa以上的壳聚糖原料，在45-70℃的微波辅助条件下反应1-5分钟，得到10-100KDa的β-C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯。所述步骤(3)微波辐射条件反应后反应液中加入反应液2-5倍体积量的无水乙醇，沉淀，室温沉化30-60min，得到的沉淀物即是不同分子量的β-壳聚糖硫酸酯的粗产品；将上述粗产品抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，再用NaOH溶液将其中和，透析(根据制备的分子量的区别，将上述溶液用1500Da或3500Da的透析袋进行透析，除盐后取透析液；)，透析液浓缩，冷冻干燥得不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。一种壳聚糖硫酸酯类化合物的应用，其特征在于：壳聚糖硫酸酯类化合物作为免疫增强剂的应用；其中，壳聚糖硫酸酯类化合物为不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。经测定可见不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖能够明显促进RAW264.7细胞产生NO，且具有剂量依赖性。不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖可显著增加RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β、COX-2、IL-1α、PGE2细胞因子的表达，且具有剂量依赖性。不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖可促进TNF-α、IL-1β、COX-2、iNOS在mRNA水平上的表达，且随着时间的延长，呈先上升后下降趋势。不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖可促进TNF-α、COX-2、iNOS在蛋白水平上的表达，且随着时间的增加，各细胞因子的蛋白表达量也增加。本专利技术所具有的优点：本专利技术所用壳聚糖硫酸酯类化合物是在壳聚糖经磺化后所得2，3，6位壳聚糖硫酸酯衍生物，并具有强聚阴离子性质，且无明显细胞毒性。同时本专利技术采用的壳聚糖硫酸酯类化合物的含硫量高，对壳聚糖原料利用率高；制备过程采用均相反应，制备方法简单快速，操作成本低，污染少。本专利技术以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为模型，通过产生的NO及IL-6、IL-lβ、IL-1α、TNF-α、PGE2等细胞因子的多少，可快速、准确地判断免疫活性强弱并了解其机理，且可检测是否有细胞毒性，为新型免疫增强剂的开发提供依据。附图说明图1为β-壳聚糖的红外表征谱图。在1645cm-1附近，β-壳聚糖只有一个氨基峰，而另一氨基峰则位于1598cm-1附近，符合β-壳聚糖结构特征。图2为分子量为3169Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1215.33cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在809.04cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。图3为分子量为5030Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1219.52cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在811.99cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。图4为分子量为14481Da的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征图谱。在1213.41cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在810.16cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3-)的存在。图5为β-壳聚糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子mRNA水平的影响。图6为β-壳聚糖硫酸酯对RAW264.7细胞因子蛋白水平表达量的影响。具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫增强剂，其特征在于：免疫增强剂的有效成分为壳聚糖硫酸酯类化合物；其壳聚糖硫酸酯类化合物为不同分子量的β‑C‑2，3，6‑硫酸酯‑壳聚糖。

【技术特征摘要】
1.一种免疫增强剂，其特征在于：免疫增强剂的有效成分为壳聚糖硫酸酯类化合物；其壳聚糖硫酸酯类化合物为不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖。2.按权利要求1所述的免疫增强剂，其特征在于：所述不同分子量的β-C-2，3，6-壳聚糖硫酸酯有效剂量为50-200μg/mL。3.按权利要求1或2所述的免疫增强剂，其特征在于：所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖，其结构式为：其中n为聚合度：4-40；该化合物的活性基团—硫酸酯基(OSO3－)的含量为30-35％。4.按权利要求1所述的免疫增强剂制备方法，其特征在于：所述不同分子量的β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：(1)磺化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌条件下滴加氯磺酸，使其在0-5℃反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5：1)-(10：1)；(2)不同分子量的β-壳聚糖的制备：将高分子量β-壳聚糖溶于过量的酸性溶液中，而后再加入双氧水混匀后于60-80℃水浴搅拌10-60分钟，得到不同分子量的β-壳聚糖；(3)β-C-2，3，6-硫酸酯-壳聚糖的制备：称取上述获得的不同分子量的β-壳聚糖，加入至甲酸或二氯乙酸中充分溶解，溶解后加入N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后，再加入上述磺化试剂，混合均匀后，于微波降解反应器中，在微波辐射条件下，40-70℃反应，反应后纯化得不同分子量的β-C-2，3，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢荣娥，杨悦，李鹏程，刘松，于华华，李克成，秦玉坤，陈晓琳，李荣锋，王雪芹，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37